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食品毒素/微生物检测

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主题：【分享】细菌内毒素检查法

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2011/6/5 23:59:19 21楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（2）大肠菌群（Coliform ） 取含适量（不少于10ml ) 的乳糖胆盐发酵培养基管3 支，分别加入1 :10 的供试液lml（含供试品0.1g或0.1ml）、1: 100 的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1:1000的供试液1 ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1 支乳糖胆盐发酵培养基管加人稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24 小时。

乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养墓的平板上，培养18～24 小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表4 所列的菌落形态特征不符或为非革兰氏阴性无芽抱杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表4 所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰氏阴性无芽抱杆菌，应进行确证试验。
表4 大肠菌群菌落形态特征

培养基	菌落形态
曙红亚甲蓝琼脂	紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐．表面光滑，湿润
麦康凯琼脂	鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润

确证试验 从上述分离平板上挑选4 ～ 5 个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24 ～ 48 小时。若产酸产气，判该乳糖胆盐发醉管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。

根据大肠菌群的检出管数，按表5 报告lg 或lml 供试品中的大肠菌群数。

表5 可能的大肠菌群数

各供试品量的检出结果			可能的大肠菌群数N （个／g 或ml )
0.1g或0.1ml	0.01g或0.01ml	0.01g或0.01ml	可能的大肠菌群数N （个／g 或ml )
＋	＋	＋	> 10³
＋	＋		10² < N < 10³
＋	―	―	10 < N < 10²
―	―	―	< 10

注：＋代表检出大肠菌群；―代表未检出大肠菌群．

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2011/6/6 0:00:09 22楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（3）沙门菌（salmonella ） 取供试品10g或10ml , 直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24 小时。

取上述培养物1ml ，接种于10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18 ～24 小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18 ～24 小时（必要时延长至40～ 48 小时）。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6 所列的特征，判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落与表6 所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2 ～3 个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18 ～24 小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验，确认是否为沙门菌。

表6沙门菌菌落形态特征

培养基	菌落形态
胆盐硫乳琼脂	无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色
沙门、志贺菌属琼脂	无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色
曙红亚甲蓝琼脂	无色至浅橙色．透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落
麦康凯琼脂	无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色

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2011/6/6 0:00:52 23楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（4）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ） 取供试液10ml （相当于供试品1g 、lml 、10cm² ) ，直接或处理后接种至适量（不少于100ml ）的胆盐乳糖培养基中，培养18 ～24 小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24 小时。

铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2 ～3 个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～ 24 小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验。

氧化酶试验

取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30 秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰氏阴性无芽抱杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素（Pyocyanin ）试验

取斜面培养物接种于PDP 琼脂培养基斜面上，培养24 小时，加三氯甲烷3 ～5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加人lmol / L 盐酸试液约lml ，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDP 琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品枪出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

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2011/6/6 0:01:25 24楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

( 5 )金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）取供试液l0ml （相当于供试品1g、lml 、l0cm²) ，直接或处理后接种至适见（不少于100ml）的亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18 ～24 小时，必要时可延长至48 小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24 ～72 小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表7 所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

表7金黄色葡萄球菌菌落形态特征

培养基	菌落形态
甘露醇氯化钠琼脂	金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7～lmm
卵黄氯化钠琼脂	金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1 ～2mm

若平板上生长的菌落与表7 所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2 ～3 个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24 小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰氏染色．并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24 小时，做血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验

取灭菌小试管3 支，各加入血浆和无菌水混合液（1 : 1 ) 0.5ml ，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml 、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml 、营养肉汤或0.9％无菌氯化钠溶液0.5ml , 即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3 管同时培养，3 小时后开始观察直至24 小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。

若上述疑似菌为非革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

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( 6 )梭菌（Clostridium ） 取供试液10ml （相当于供试品1g 、lml 、10cm² ) 2 份，其中l 份置80 ℃ 保温10 分钟后迅速冷却。上述2 份供试液直接或处理后分别接种至100ml 的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48 小时。取上述每一培养物0.2ml ，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48～72 小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2 ～3 个菌落分别进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氢酶试验

取七述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3 ％过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰氏阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶试验阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。

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( 7 )白色念珠菌（Candida albicans） 取供试液10ml （相当于供试品1g 、lml 、l0cm²）直接或处理后接种至适量（不少于10Oml）的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养48 ～72 小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24 ～48 小时（必要时延长至72 小时）。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2 ～ 3 个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48 小时（必要时延长至72 小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。

若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色．挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上．培养24～48 小时。取培养物进行染色、镜检及芽管试验。

芽管试验

挑取l％聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，于35～ 37 ℃ 培养1 ～3 小时，置显微镜下观察孢子上有否长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰氏阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。

结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3 次结果的平均值报告菌数。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定．判供试品不符合规定。

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2011/6/6 0:03:16 Last edit by 7336167

yuduoling

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不错的资料分享。

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cavalry119

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2012/4/14 0:15:04 28楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

楼主，有个问题想咨询一下你，就是在内毒素的凝胶法正式干扰试验中，为什么只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效？？溶液A都为阴性了，那再然后的半定量的检测中，供试品溶液或稀释液还能有阳性反应么？刚开始做细菌内毒素的检测，还不怎么明白，希望能给解释解释，谢谢！

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