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主题：【原创】【极限体验】Ultimate C18柱分析黄酮代谢产物在大鼠尿液中的降解(6月份)

浏览0 回复33 电梯直达
幽灵龙猫
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发表于：2011/06/30 23:14:25 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被月旭科技--小S设置为精华； 奖励积分记录： 月旭科技--小S(20分)
前言
  药物代谢(drug metabolism)是研究药物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律的一门科学，即药物分子被机体吸收后，在机体作用下发生的化学结构转化。也是药物研发产业链中的重要环节，贯穿药物研究过程的始终。本实验涉及黄酮类成分在大鼠体内代谢的研究，大鼠灌胃给予药物，累积24h尿液，尿液经处理，运用各种色谱手段，分离得到目标代谢产物。在此过程中有一关键的因素时刻威胁着我们，即代谢产物的降解，因此要设法保证代谢产物的稳定，如低温保存样品，调节尿液的酸碱性，等等。
  本实验利用Ultimate XB-C18对两个重要的代谢产物在尿液中的稳定性进行简单的考察。
1.Chemical and reagents
  甲醇(色谱纯，天津大茂)，水(哇哈哈纯净水，杭州)，三氟乙酸(TFA, Dikma, USA)，其它试剂均为分析纯。
2.animals
    Wista大鼠(220-250g，SPF级，由本校动物实验中心提供)
3.HPLC analysis of two important metabolites
    Waters 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]系统，由Waters Model 600 controller液相色谱，Millennium 32 工作站，Model Delta 600 泵，以及Waters 996 DAD检测器组成。
    色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm)
    流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05%TFA)=(20:80, v/v)
    流  速：1mL/min
    柱  温：35℃
    检测波长：190-400nm扫描
    进样量：20μL
3.Sample preparation
    代谢产物M1和M2之前已制备分离得到，各取1mg，混合溶于2mL水中(M1和M2水溶性很强，也可溶于甲醇)，取20μL进样分析；剩余部分置于250mL锥形瓶中，加入新鲜收集的大鼠尿液10mL，室温放置24h，之后该混合溶液，过ODS亲水柱，先用水洗脱，弃去，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱溶液，45℃浓缩并定容至2mL。取20μL进样分析。
4.Results and discussion


图1. M1与M2纯品混合色谱图


图2. M1与M2纯品混合色谱图(局部放大图10-20min)


图3. M1与M2在尿液中放置24h后色谱图


图4. M1与M2在尿液中放置24h后色谱图(局部放大图20-30min)

5.conclusion
  1. M1与M2在尿液中放置24h后发生了降解，在保留时间为25分钟左右，出现2个降解产物，其紫外吸收与M1和M2分别对应相似，M1紫外吸收(~271nm, ~310nm), M2紫外吸收(~273nm, ~343nm)。
  2. 降解产物可能为M1与M2水解产物，因为M1与M2为极性较大的代谢产物，推测可能为葡萄糖醛酸或硫酸结合产物，其降解过程可能为水解脱掉葡萄糖醛酸基或硫酸基。
  3. 这样的结果提示我们，在研究黄酮类成分的代谢过程中要注意样品的保存，在收集到尿液后要快速处理，或者在收集的过程中就进行预防，所采用的方法文献报道有加入乙醇或加酸调pH至5左右，可以防止该类代谢产物的降解。
Acknowledgement
感谢月旭公司提供Ultimate XB-C18柱。
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雪妖
czj_1027
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2011/7/1 10:05:23 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
又看见龙猫的大作了，恭喜 又完成一个项目了
有两个小问题要请教下：
1、你的流动相的选择思路可以分享一下吗？
2、药代的前处理中，开始的时候是将M1和M2灌胃，收集尿液，后面结论的时候是M1与M2在尿液中放置24h后发生了降解，这两种处理的方式不一样，各是什么目的呢？我没有做过药代，呵呵，所以不太明白。

谢谢龙猫

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2011/10/8 11:51:13 Last edit by samanthalas
samanthalas
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2011/7/1 10:25:15 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请问小杜,大鼠的新鲜尿液如何收集啊?

起初你是怎么样克服与大鼠并肩工作的心理不适?
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samanthalas
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2011/7/1 10:32:18 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
M1和M2是不是就算放在水中24小时,也会降解的啊?
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幽灵龙猫
xiaodu2007693
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2011/7/1 11:03:53 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 雪妖(czj_1027) 发表:
又看见龙猫的大作了，恭喜 又完成一个项目了
有两个小问题要请教下：
1、你的流动相的选择思路可以分享一下吗？
2、药代的前处理中，开始的时候是将M1和M2灌胃，收集尿液，后面结论的时候是M1与M2在尿液中放置24h后发生了降解，这两种处理的方式不一样，各是什么目的呢？我没有做过药代，呵呵，所以不太明白。

谢谢龙猫

谢谢雪版主的支持
就版主想了解的两个问题，我就我所知道的回答如下：
1. 流动相选择思路，要依据成分的性质，这个两个代谢产物，M1和M2是我废了九牛二虎之力才分离得到的，大概用了1个多月，二者的性质我很了解，大极性，爱拖尾，所以选择20%的甲醇水，在15分钟左右出峰，且需要加TFA，否则峰形很差。
2. 这个问题比较混乱，可能是我没交代清楚，实验思路是，大鼠灌胃给予原形药物，研究尿液中的代谢产物，M1和M2就是从尿液中通过各种手段分离得到的，且结构已经通过波谱数据手段得到确认(涉及保密所以没附结构)，此实验的目的是考察二者在尿液中的稳定性，后期可能还会分离其降解产物，及后面的两个小峰。
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幽灵龙猫
xiaodu2007693
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2011/7/1 11:06:49 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 samanthalas(samanthalas) 发表:
请问小杜,大鼠的新鲜尿液如何收集啊?

起初你是怎么样克服与大鼠并肩工作的心理不适?

大鼠新鲜尿液有专门的代谢笼来收集，代谢笼可以把粪便和尿液得到很好的分离
和大鼠并肩工作快半年了啊，经常换垫料空气还是很清新的 哈哈
做多了发现凡是涉及到大鼠的实验现在就会浑身感到不适
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xiaodu2007693
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2011/7/1 11:09:26 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 samanthalas(samanthalas) 发表:
M1和M2是不是就算放在水中24小时,也会降解的啊?

这个肯定是不会的
黄酮类化合物在一般的有机试剂中包括水都是非常稳定的。
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samanthalas
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2011/7/1 11:15:45 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 幽灵龙猫(xiaodu2007693) 发表:
原文由 雪妖(czj_1027) 发表:
又看见龙猫的大作了，恭喜 又完成一个项目了
有两个小问题要请教下：
1、你的流动相的选择思路可以分享一下吗？
2、药代的前处理中，开始的时候是将M1和M2灌胃，收集尿液，后面结论的时候是M1与M2在尿液中放置24h后发生了降解，这两种处理的方式不一样，各是什么目的呢？我没有做过药代，呵呵，所以不太明白。

谢谢龙猫

谢谢雪版主的支持
就版主想了解的两个问题，我就我所知道的回答如下：
1. 流动相选择思路，要依据成分的性质，这个两个代谢产物，M1和M2是我废了九牛二虎之力才分离得到的，大概用了1个多月，二者的性质我很了解，大极性，爱拖尾，所以选择20%的甲醇水，在15分钟左右出峰，且需要加TFA，否则峰形很差。
2. 这个问题比较混乱，可能是我没交代清楚，实验思路是，大鼠灌胃给予原形药物，研究尿液中的代谢产物，M1和M2就是从尿液中通过各种手段分离得到的，且结构已经通过波谱数据手段得到确认(涉及保密所以没附结构)，此实验的目的是考察二者在尿液中的稳定性，后期可能还会分离其降解产物，及后面的两个小峰。


我还以为M1和M2是买了现成标准品呢.
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xiaodu2007693
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2011/7/1 12:07:01 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 samanthalas(samanthalas) 发表:
我还以为M1和M2是买了现成标准品呢.

我们专业买标准品的话就显得没水平啦 哈哈
标准品要自己制备才显示实力
M1和M2是代谢产物的缩写，Metabolite 1和 Metabolite 2
代谢产物是未知的，更不能购买纯品了
很珍贵的，我用1mg做的，很心疼啊，之前1个月，M1累积分离了10mg，M2累积了12mg。
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kaikaifeng
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2011/7/1 12:56:50 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
恭喜，由两个产物分解成四个，你又多了两个化合物
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阿三
junqiwudi
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2011/7/1 13:35:10 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
什么原因导致的分解呢？
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