主题：【第六届原创】用柱后衍生荧光法测定氨基甲酸酯类农残

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发表于：2011/07/15 15:19:20 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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摘要：目的：用高效液相柱后衍生荧光检测系统测定水果、蔬菜中氨基甲酸酯类农残的残留量；方法：采用甲醇：水为流动相梯度洗脱，Ultimate XB-C18， 4.6×250mm，5μm色谱柱分离，激发波长为330nm、发射波长为465nm；结果：该方法平均回收率为72.91％～114.96％，RSD为1.094％～1.377％，在信噪比S:N=3的条件下，其空白回收检测限在0.01～0.06ppm范围内。结论：该方法对水果、蔬菜中氨基甲酸酯农残含量结果稳定，重现性好，可操作性强,适用于水果、蔬菜中氨基甲酸酯农残残留量的定性定量检测。

关键词：氨基甲酸酯；水果、蔬菜；高效液相色谱法

氨基甲酸酯类农药是目前我国使用量较大的杀虫剂之一，是继有机磷、有机氯类农药后发展较为迅速的一类高效、广谱杀虫剂，主要应用于粮食、蔬菜和水果上。氨基甲酸酯类杀虫剂的杀虫作用机制为抑制昆虫神经传导的重要物质乙酰胆碱酯酶，氨基甲酸酯类农药进入虫体后 ,与乙酰胆碱酯酶结合 ,形成氨基甲酰化酶 ,使乙酰胆碱酯酶无法水解乙酰胆碱,致使神经突触部位乙酰胆碱大量积累，对突触后膜产生连续不断的刺激作用，昆虫在连续不断的神经刺激下，出现兴奋、痉挛、最后瘫痪、死亡。其具有较强的杀虫效果、分解速度快、代谢迅速，残留期短等特点，此外还常被作为杀菌剂、除草剂和生长调节剂。由于其广泛利用于各种农作物，残留在蔬菜、水果等农作物的氨基甲酸酯类农残严重危害到人体的健康，同时也对地下水产生了严重的污染。

本方法在国标NY/T 781 -2008蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定的基础上，结果公司的高效液相色谱仪LC310仪器特点，优化色谱条件，重新研究建立了测定水果、蔬菜中氨基甲酸酯类农残检测的高效液相柱后衍生色谱法，该方法简便、快速，实用性强，回收率良好，检测结果稳定可靠。

1 实验：

1.1 仪器和试药

1.1.1 仪器

LC310高效液相色谱仪（包括LC-P310高压恒流泵、FLD荧光检测器、柱后衍生泵，水解泵，均为江苏天瑞仪器股份有限公司产品）；电子天平（赛多利斯）；超声波清洗器（张家港神科超声）；超纯水机（南京易普易达）；食品加工器；匀浆机；氮吹仪。

1.1.2 试剂

氨基甲酸酯农残对照品（浓度均≥96.00%）；固相萃取柱；OPA稀释液、邻苯二甲醛、氢氧化钠、巯基乙醇，均为分析纯；甲醇、乙腈、二氯甲烷（色谱纯）；氯化钠（140度烘烤4小时）；水（超纯水，自制）；水果、蔬菜购买至菜市场。

注：柱后衍生试剂 OPA试剂制备：

1.将945mlOPA稀释剂倒入试剂瓶，留5ml第五步用。

2.盖上瓶盖，打开进气阀，开启气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10分钟

3.将100mgOPA溶解于10ml色谱纯甲醇中。

4.关闭气源，打开瓶盖。将OPA溶液倒入已经去氧的稀释液中。

5.溶解2g巯基乙醇与第一步留下的5mlOPA稀释液中并倒入试剂瓶。

6.盖上瓶盖，打开气源，使其喷射几分钟后关闭气阀。轻轻摇动试剂使其完全混匀。

固相萃取柱：氨基柱（Aminopropyl），容积6mL，填充物500mg。

1.2 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18,4.6×250mm，5μm，月旭材料（上海）公司；

流动相A：甲醇

流动相B：水

流速：0.8 ml/min

柱温：30℃

进样量：10μL

荧光检测激发波长：330nm；发射波长：465nm；

水解试剂0.05mol/L氢氧化钠；水解温度100℃；水解流速为0.3mL/min

衍生试剂OPA；衍生温度35℃；衍生流速为0.3mL/min

时间梯度程序如下：

T（min）	流动相A	流动相B
0	30	70
10	45	55
19	80	20
28	80	20
29	30	70

1.3 标准物质溶液的配制

1.3.1 单个农药标准溶液：将氨基甲酸酯类农残标准物质用甲醇溶剂转移并定容至2mL的棕色容量瓶中，摇匀，逐一配制成50ppm的标准储备液，贮存在-18℃以下冰箱中。使用时用甲醇稀释成所需的工作标准液。

1.3.2农药混合标准溶液：根据各农药在仪器上的响应值，逐一准确吸取一定体积的单个农药分别注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成农药混合标准储备溶液，使用前用甲醇稀释成0.5μg/ml的标准工作液。如图1所示

图1：氨基甲酸酯对照品溶液

1.4 样品制备及前处理步骤

1.4.1 样品处理

按GB/T 8855 抽取蔬菜、水果样品，取可食部分后，将其切碎，充分混匀放入食品加工器粉碎，制成待测样。放入分装容器中，于-20℃～-16℃条件下保存，备用。

1.4.2 提取

准确称取25.0g试样放入匀浆机中，加入50.0mL乙腈，在匀浆机中高速匀浆2min后用滤纸过滤，滤液收集到装有5g～7g氯化钠的100mL具塞量筒中，收集滤液40mL～50mL，盖上塞子，剧烈震荡1min，在室温下静置30min，使乙腈相和水相分层。

1.4.3 净化

从100mL具塞量筒中准确吸取10.00mL乙腈相溶液，放入150mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，杯内缓缓通入氮气或空气流，将乙腈蒸发近干；加入2.0mL甲醇十二氯甲烷（1+99）溶解残渣，盖上铝箱，待净化。

将氨基柱用4.0mL甲醇十二氯甲烷（1+99）预洗条件化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即加入上述待净化溶液，用2mL甲醇十二氯甲烷（1+99）洗烧杯后过柱，并重复一次。将离心管置于氮吹仪上，水浴温度50℃，氮吹蒸发至近于，用甲醇准确定容至2.5mL。在混合器上混匀后，用2μm滤膜过滤，待测。

2.1 色谱条件的优化

通过多次调节流动相的比例，氨基甲酸酯农残标准物质的理论塔板数都大于5000，分离度均大于1.5，得最佳色谱条件。

2.2 峰位确定

将各标准品配制成单标，按本方法确定的色谱条件，取各单标和混标10μl进样测定，按各保留时间确定出峰顺序，出峰顺序为：涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲奈威、异丙威、仲丁威。

2.3 线性关系和检测限

在本方法确定的实验条件下，涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭砜、速灭威、克百威、甲奈威、异丙威、仲丁威在进样量0.5ng～25ng之间，线性关系良好，各化合物的相关系数见表5-1。在S/N=3的条件下，确定各组分的检测限也列入表5-1中。

组分	线性范围	线性方程	相关系数	检测限（mg/L）
涕灭威亚砜	0.5ng～25ng	Y=0.0314x-0.008	0.9995	0.001
涕灭威砜	0.5ng～25ng	Y=0.032x-0.0016	0.9994	0.001
灭多威	0.5ng～25ng	Y=0.0272x-0.0066	0.9995	0.001
三羟基克百威	0.5ng～25ng	Y=0.0029x-0.0021	0.9994	0.005
涕灭威	0.5ng～25ng	Y=0.0313x+0.0052	0.9997	0.005
速灭威	0.5ng～25ng	Y=0.0398x-0.0015	0.9995	0.002
克百威	0.5ng～25ng	Y=0.0456x+0.0037	0.9996	0.006
甲奈威	0.5ng～25ng	Y=0.0443x-0.0145	0.9993	0.002
异丙威	0.5ng～25ng	Y=0.00475x+0.0085	0.992	0.004
仲丁威	0.5ng～25ng	Y=0.0411x+0.0077	0.9991	0.01

2.4 实际样品的测试

本次实验主要针对水果、蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的检测，采用此方法对部分水果中农残的检测结果如下表所示。

氨基甲酸酯类农残的含量(mg/kg)	水果、蔬菜
氨基甲酸酯类农残的含量(mg/kg)	苹果	梨	青菜
涕灭威亚砜	未检出	未检出	未检出
涕灭威砜	未检出	未检出	未检出
灭多威	未检出	未检出	未检出
三羟基克百威	0.5	未检出	0.1
涕灭威	未检出	未检出	未检出
速灭威	未检出	未检出	未检出
克百威	未检出	未检出	0.1
甲奈威	未检出	未检出	未检出
异丙威	0.67	0.16	未检出
仲丁威	未检出	0.31	未检出

2.5 回收率试验

采用在实际样品中加入不同添加水平的混标的方式进行回收率实验，前处理方法处理后分析，采用外标法定量，每个添加水平单独测3次，实验结果表明，其平均回收率为72.91％～114.96％，RSD为1.094％～1.377％。

3 结论

经实验表明：本方法利用高效液相色谱衍生化荧光检测系统检测氨基甲酸酯类具有简便、快速、灵敏高等特点。