(4)实时PCR 常规PCR检测,需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定,转移过程中易污染,造成假阳性,而且耗费时间。1996年,Tyagi开创了一种实时PCR(Real-timePCP,)。实时PCR是在,PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman.探针或茎环型荧光分子信标探针,在墓因扩增过程中,与产物杂交,此时,报告基团和淬灭基团分开,根据能量共振转移现象,报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单,闭管检测,减少污染,灵敏度高,并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测,面且可以进行临床大规模快速检测。
2003年,Blackstone等针对tdh设计荧光分子信标探针,对从牡蛎中富集的13个不同种类的菌株进行实时PCR检测。结果显示,只有含tdh的V.p才被检测出来,特异性好,灵敏度高,能把每个纯培养体系的1个CFU检测出来。实时PCR检测快速准确,但需要价格昂贵的荧光检测仪和荧光分子标记探针,一般的实验室不能广泛开展。分子信标实时PCR技术自1996年开创以来短短几年就得到蓬勃的发展,相信随着经济的发展、技术的进步、实时荧光检测仪的昔及,将会得到更为广泛的应用。