鉴定原理 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌,是由这两类菌的
细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用
乙醇或
丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中
肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,
通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色,呈现蓝紫色。
实验流程 1、 取载玻片用纱布擦干,载玻片的一面用marker笔画一个小圈(用来大致确定菌液滴的位置)。涂菌的部位在火焰上烤一下,除去油脂。
2、 涂片:
液体培养基:左手持菌液试管,在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖;右手持接种环在火焰中烧灼灭菌,等冷却后从试管中沾取菌液一环,在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基:先在载玻片上滴一滴无菌水,再用接种环取少量菌体,涂在载玻片上,使其薄而均匀。
3、 晾干:让涂片在空气中自然干燥。
4、 固定:让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)。
5、 染色:将固定过的涂片放报纸上,滴加草酸铵结晶紫液,染1min。
6、 水洗:用水缓慢冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
7、 媒染:滴加1滴碘液,染1min,水洗。
8、 脱色:吸去残留水,连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色,立即水洗。
9、 复染:滴加蕃红复染3-5min,水洗。至此,革兰氏染色结束。
可能误差 在实验中经常会出现
假阳性和假阴性的结果,假阳性主要是由于脱色不完全,可能是由于涂片过厚,或者是结晶紫染色过度,导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度,造成细胞壁通透性的改变,而出现假阴性结果;另外,细胞培养时间太长,可能已经有部分细胞发生死亡或者
自溶,也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。