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液相色谱（LC）

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主题：【第六届原创】一波三折的样品方法调试过程（9月）

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huaibeijiayuan

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发表于：2011/09/23 20:57:42 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为huaibeijiayuan原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

因受市场行情波动的影响，公司一个产品原材料A（因涉及公司秘密，因而用字母代替）变得比较紧缺，而此产品又是公司的主打产品，为了减少或取消这种市场对公司产品的冲击，去年公司领导层经过多次论证，决定新上一个项目------生产A原料。生产车间是去年年初进行土建工程建设，在去年下半年进行安装调试并进行了试生产，刚开始生产还比较顺利，产率与理论相接近，随着生产的持续进行，发现检测结果与生产成本的误差越来越大，因此就开始查找原因。

作为检验部门首先就是检查方法的可行性和正确性，排除操作带来的误差。后来技术部门提出这个产品的异构体变大导致结果虚高，当时的检测方法是化学滴定法，异构体也会参与反应，最终导致检测结果虚高。于是我们部门就开始查找资料，摸索其他的分析方法，这个产品为有机酸类，因此考虑用HPLC进行分析，但在网络上查找不到相关的分析方法的介绍，意味着需要自己摸索。

首先取出反应液做个波长扫描，发现在220-250nm、230-245nm、240-260nm分别有较强的紫外吸收，通过分析、确认，判断出220-250nm和240-260nm为此产品的两种主要原料，230-245就是我们的产品，因此最终确定检测波长定为240nm。波长确定后就是选择流动相了，考虑的样品为有机酸，在溶液中应该有很好的溶解性，初步确定为甲醇和水，谁知出现一个两难的问题：甲醇比例大，组分分不开；甲醇比例小，分析时间太长；甲醇与水同等比例吧，泵压太高了，最终放弃甲醇作流动相，次而选择乙腈。

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2011/9/23 20:59:24 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

因为当时有个乙腈/水=60/40的流动相就先进一针试试吧，主峰在7min左右，原料在14min'左右出来，另一个原料在3min左右，考虑到不知是否还有其他杂质，于是选用了一个梯度的检测方法，色谱柱选用的是月旭的AQ-C18色谱柱，流动相为乙腈/水（0.1%三氟乙酸）=60/40，为什么用三氟乙酸呢？刚才已经说了是临时借用的其他产品的流动相调试的，所以就没有做改动了。

分析条件：

色谱柱：上海月旭公司的AQ-C18色谱柱；250mm*4.6mm，5um

梯度方法：流动相：A/B=ACN/0.1%三氟乙酸梯度

0 60 40

13 95 5

22 60 40

这是分析的谱图。图片1

从谱图上看，组分的异构体没有显现出来，当时的样品是主产品：异构体=1:1，谱图中仅显示一个组分，并且将主产品和异构体分别进样分析，保留时间是基本一致，由此基本可以确定异构体没有分离出来。

之后调整流动相的各种比例，效果不是很理想。后来将流动相的缓冲盐更换为磷酸二氢钾，见下图，效果还是不行。

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2011/9/23 21:01:12 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

因为手边色谱柱不是很多，再说自己单方面摸索时间也耗得比较久，于是就寻求色谱柱厂家的帮助，国产色谱柱厂家与月旭公司比较熟悉，就咨询月旭公司的应用工程师，将相关资料与工程师沟通后，月旭工程师推荐了一款苯基柱，PFP-C18，250mm*4.6，5um色谱柱。当时就申请试用，第三天就收到了这款色谱柱，方法基本没有都大的变化。

分析条件：

色谱柱：上海月旭公司的PFP-C18色谱柱；250mm*4.6mm，5um

梯度方法：流动相：A/B=ACN/0.1%磷酸二氢钾恒流（见图2）

从这张谱图看，异构体能明显分离出来，但分离效果不是很理想，并且保留时间接近20min了，如果要达到足够的分离，必须增加水的比例，但这样造成的后果是保留时间更长，分析时间太长对于生产控制来说绝对不是一个很好的分析方法，所以最终放弃了。

再次与月旭工程师联系后，工程师推荐了另一款LP-C18色谱柱，250mm*4.6mm，5um于是继续申请试用。

在接到试用的色谱柱后，按照原有的方法进行了摸索。这是分析的谱图，（图3）样品按照1:1的比例，基本达到了基线分离，再说实际生产的样品，异构体的比例不可能有这么多，正常的反应粗品异构体含量一般在5%以下，因此完全可以达到控制要求，分析时间相对来说也不是很长，于是基本决定选用这根色谱柱了。

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2011/9/23 21:02:16 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

最后所要做得就是在此基础上对方法进行进一步优化，这是优化后的样品分析谱图。（图4）当然这个方法可能不是最好的，但目前来说是个比较适合的方法。13.28min的组份就是我们所需用监控的异构体。

通过这次一波三折的方法调试，告诉我们：对一个产品的方法开发，首先需要查找相关资料，如果有现成的分析方法，我们会减少很多的调试时间；如果查找不到只能依靠自己的摸索，对于HPLC来说，关键在于确定检测波长，组分的分离度主要靠色谱柱的选择，这就相对比较简单了；在摸索过程中一定不要忘记寻求专家的帮助，特别是色谱柱生产厂家的工程师帮助，对于一个工厂来说，选择色谱柱的空间相对来说比较狭小，但对于生产厂家来说，选择的范围就扩展了很多，同时这些工程师的分析经验也是比较丰富，能帮助你减少很多的弯路。

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2011/9/23 21:03:36 Last edit by huaibeijiayuan