主题：【原创】【极限体验】Ultimate XB C18柱分析某黄酮成分胆汁中的代谢产物

前言
  药物代谢(drug metabolism)是研究药物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律的一门科学，即药物分子被机体吸收后，在机体作用下发生的化学结构转化。也是药物研发产业链中的重要环节，贯穿药物研究过程的始终。排泄是药物代谢研究过程中的一个重要环节，本实验涉及的是某黄酮成分在大鼠体内排泄的研究。
1.Chemical and reagents
  甲醇(色谱纯，天津大茂)，水(哇哈哈纯净水，杭州)，三氟乙酸(TFA, Dikma, USA)，其它试剂均为分析纯。
2.animals
    Wista大鼠(220-250g，SPF级，由本校动物实验中心提供)
3.HPLC analysis of two important metabolites
    Waters 高效液相色谱系统，由Waters Model 600 controller液相色谱，Millennium 32 工作站，Model Delta 600 泵，以及Waters 996 DAD检测器组成。
    色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm)
    流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05%TFA) 梯度洗脱，具体流程未透露
    流  速：1mL/min
    柱  温：30℃
    检测波长：190-400nm扫描
    进样量：20μL
3.Sample preparation
    大鼠灌胃给予该成分，剂量为30mg/200g，15min后用20%的乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，行胆汁插管手术，缝合伤口，用规格为15mL的离心管收集12h内的胆汁，收集的胆汁过ODS，水洗脱，之后用甲醇洗脱，甲醇洗脱部分定溶到某体积，取一定体积过0.45μm微孔滤膜，HPLC分析，相同条件下与尿液中的代谢产物进行对照，确定该成分经大鼠灌胃后胆汁中排泄的代谢产物。
4.Results and discussion

Fig. 1. The HPLC chromatogram of blank bile.

Fig. 2. The HPLC chromatogram of bile sample(12h).

Fig. 3. The HPLC chromatogram of urine sample.

讨论1. 首先要说明的是此部分实验是之前实验的续集，所以之前的实验请参考我以前发的体验贴，图3给出的是尿液中代谢产物的色谱图，从图中我们可以很明确地看到8个代谢产物的色谱峰，这8个色谱峰已经通过各种柱色谱手段分离得到，且结构已经用1D NMR和2D NMR以及MS等谱学手段进行了鉴定。
讨论2. 图1和图2 分别为胆汁空白和样品色谱图，从该结果可知，有5种主要的代谢产物（M1 M2 M5 M6和M7）以及少量的M8经胆汁排泄，主要是通过保留时间，和紫外吸收进行了指认。
讨论3. 此外我们还发现，尿液中大量存在的代谢产物M3不经胆汁排泄。
讨论4. 通过对该成分在大鼠尿液中的代谢和胆汁排泄研究，我们可以得出这样的结果，尿液的内源性成分多为极性较大成分，多集中在保留时间靠前的范围，而胆汁中的内源性物质极性较小，如图2中50min左右的成分。
讨论5.该实验尚未发表，因此代谢产物的结构不便透露，待发表之后，具体的结果会和广大息友进行交流。
讨论6.最后也是最重要的，Ultimate XB C18柱对该类代谢产物表现了良好的保留能力和分离性能，代谢产物因为其结构中会结合亲水基团，如硫酸基，葡萄糖醛酸基等使其极性增加，易于从体内排出，因此这些成分往往表现了比较差的色谱行为，如强酸性导致的拖尾现象，因此需要在流动相中加入酸或者其它试剂进行调节，本实验流动相均为甲醇：水（含0.05%TFA），在此条件下，这些代谢产物在Ultimate XB C18柱上表现了良好的色谱行为。