续 之前地沟油的消息风靡一时,其实地沟油早不是一天两天的事情,基本上是隔几年就会翻出来炒作一番,前期网上有公布一项关于鉴别地沟油中四种特征性物质的介绍,其中提到了胆固醇一项,曾经是这么说的:核心揭秘:4类指标让地沟油现出原形 第一项指标:多环芳烃(PAHs)。多环芳烃是食用油加热如炒、烤、炸、煎等后产生的含多个苯环的芳香族化合物,属于持久性有机污染物,绝大多数PAHs已被国际癌症研究中心列为致癌物。 第二项指标:胆固醇。食用植物油中一般不含胆固醇或含量极低。技术人员根据地沟油中可能含有动物源性成分,推断如果检出胆固醇并超过一定范围,可怀疑该油脂为地沟油。 第三项指标:电导率。正常油脂几乎是不导电的,但油脂酸败后产生的各种极性物质可使油脂产生导电性。地沟油由于掺杂了大量金属离子而产生导电性,电导率较高。 第四项指标:特定基因组成。地沟油是多种不同来源的废弃油脂混合而成,往往含有动物油脂,检测人员根据分子生物学基因鉴定方法,鉴定油脂中的动物基因,来判定食用油中是否含有动物源性成分。(此内容引自仪器信息网资讯中心)当时这则消息在很多大小网站都能找到,于是在领导的指示下,我们实验室也积极开展此项工作,因多环芳烃之前已经有做过,而电导率和特定基因组成与公司的产品没有直接的关系,所以我们选取了第二项:胆固醇着手实验。而当我们的实验进行到大约一半的时候,又有一则官方消息公布,消息大概内容是这样的:2011年10月13日, 距离9月中旬公安部公布破获跨省地沟油大案已有一个月的时间,卫生部新闻发言人邓海华昨日透露,目前征集到的5种地沟油检测方法特异性不强,有关部门将再向社会公开征集方法。 资料显示,从各国情况看,目前,地沟油并无特效的检测技术(此内容引自仪器信息网资讯中心)。当时看到这个消息的时候,我想我这个项目还要不要继续了,总不能半途而废吧,于是把原本的题目“通过检测胆固醇鉴别地沟油”改为了“用液相色谱法测试油类样品中胆固醇的含量”。其实做到后面,我也考虑到一个很严肃的问题,我到底去哪找有代表意义的地沟油样品呢,如果没有这样的代表样品做验证,那也是文不对题…….言归正传,发正文实验部分。1 实验部分1.1 仪器和试剂LC310高效液相色谱仪,江苏天瑞仪器股份有限公司产品;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;磁力搅拌加热器,海门市其林贝尔科技有限公司;氮吹仪,北京市优晟联合科技有限公司;超声波清洗器,张家港市神科超声电子有限公司;超纯水机,南京易普易达科学发展有限公司;甲醇、乙腈、异丙醇、无水乙醇,均为色谱纯,美国TEDIA;乙醚、氢氧化钾、氯化钠、超纯水,均为分析纯;上海强顺化学试剂有限公司;石油醚,分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司;胆固醇标准物质,纯度≥99.0%,美国accustandard. 公司提供。1.2 分析条件 色谱柱:Ultimate XB-C18色谱柱:4.6mm×150mm,5μm,月旭材料科技(上海)有限公司;流动相:乙腈:异丙醇=85:15流速:0.6mL/min;柱温:38℃;检测波长:208nm;进样量:10μl。1.3 标准溶液的配置标准储备液:准确称取胆固醇标准物质49.38mg(精确至0.1mg),用无水乙醇定容至50ml,配制成987.6ug/ml的储备液,放置于4摄氏度密封可贮藏半年。标准工作溶液:分别吸取标准储备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml,用无水乙醇定容至10ml,配制成98.76ug/ml、197.52ug/ml、296.28ug/ml、493.8ug/ml浓度标准溶液。图1为浓度为197.52ug/ml的标准溶液色谱图:
图1 浓度197.52ug/ml胆固醇标准溶液色谱图
1.4 样品处理皂化 称取油样2g,精确至0.0001g,置于100ml平底烧瓶中,加入30ml无水乙醇,5ml 60%氢氧化钾和10ml水,混匀。将试样在80℃水浴条件下磁力搅拌加热器上皂化回流0.5~1h(以皂化液透明清晰为皂化终点),用5ml乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部,取下平底烧瓶,冷却至室温。提取 定量转移全部皂化液于250ml分液漏斗中,先用30ml水分两次冲洗平底烧瓶,洗液并入分液漏斗,再用40ml石油醚和乙醚混合液(体积比为1:1)分2~3次冲洗平底烧瓶,并入分液漏斗,振摇2min,静置,分层,转移水相于第二个分液漏斗,再用30ml石油醚和乙醚混合液(体积比为1:1)重复提取两次,弃去水相,合并三次有机相,用5%盐水每次100ml洗涤提取液至中性,初次水洗时轻轻旋摇,防止乳化。提取液通过约10g无水硫酸钠脱水,转移至300ml蒸发皿中。浓缩 将上述蒸发皿至于氮吹仪上吹干,用5ml乙醇溶解定容,溶液经过0.45微米过滤膜过滤,收集清液于进样瓶中,待色谱仪测定。2 结果与讨论2.1流动相的选择分别考察了甲醇水、乙腈水、乙腈和异丙醇及不同比例,来检测胆固醇,发现甲醇水和乙腈水在检测样品的时候干扰峰较大,对定性定量带来一定难度,所以以乙腈和异丙醇来作流动相,经过不同比例的乙腈和异丙醇来分离杂质峰和胆固醇峰,优化得乙腈:异丙醇=85:15最好,杂质峰干扰最小,峰形最好。在流动相流速上,因为有异丙醇作流动相,粘度大,所以流速选用0.6ml/min。2.2波长选择利用二极管阵列检测器,对胆固醇标准品进行三维谱图扫描,发现胆固醇的最佳吸收波长在205nm处,又因为接近溶剂峰的截止波长,基线噪音及漂移比较大,所以选择208nm。2.3 精密度试验 取浓度为197.52ug/ml胆固醇标准溶液,连续进样6针,每针10ul,进行测定,考察各组分峰面积的相对标准偏差,结果见表1:图2 精密度实验谱图表1 精密度试验结果
Table . 1 Precision of experimental data
组分 | 峰面积 | 平均峰面积 | 相对标准偏差(RSD%) |
胆固醇 | 121271.8 | 121938.7 | 1.16 |
120882.9 |
120758.5 |
122108.2 |
122012.0 |
124598.7 |
2.4 线性关系和检测限 在本方法确定的实验条件下,胆固醇的标准品进样量在50ng ~ 1000ng之间,线性关系良好。图3线性关系色谱图
图4 线性关系方程2.5 回收率试验采用在实际样品中加入不同添加水平的混标的方式进行回收率实验,按 1.4中的方法处理后分析,采用外标法定量,每个添加水平单独测3次,实验结果表明,其平均回收率为为81.04%,RSD为1.15%。 2.6 实际样品的测试采用HPLC法测试部分食用油的结果如表3所示。样品名称 组分含量/(mg.kg-1) | 自家菜籽油 | 色拉油 | 炒菜剩油 | 调和油 | 猪油1 | 猪油2 |
胆固醇 | 未检出 | 60.85 | 132.15 | 65.25 | 942.5 | 833.95 |
表5 样品检测结果
3、结论 通过对不同动植物油类胆固醇含量的测定,动物油中如猪油中胆固醇含量较高,而植物油中如果是纯正植物油,如自家菜籽油,是没有胆固醇的,而在我们抽查的色拉油、调和油等,均含有一定量的胆固醇。当然这个也不能作为判断油品质好坏的关键指标,但是可以有一定的借鉴意义。