主题：【分享】毛细管电泳定量分析健康成人及地中海贫血携带者的Hb A2

血红蛋白A2(hemoglobin A2,Hb A2)是红细胞中的次要成分，在红细胞中的含量较少，但却是临床诊断血红蛋白病的重要指标[1、2]。国外通常用于对Hb A2定量的方法有微量色谱法和全自动高效液相色谱法[3]；国内常用的 Hb A2定量方法是碱性电泳法和柱层析法。

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis ,CE)技术综合了电泳和色谱技术两者的优点，因具有高效、快速、简便、自动化操作和在Hb A2的检测方面优于离子交换微柱层析法等特点而被用于常规临床化学和血红蛋白定量分析[4－7]。本研究中，我们将CE技术用于定量测定Hb A2和异常血红蛋白(Hb E)的定性分性，并对CE技术用于地贫的筛查进行了方法学评价。
1  对象与方法
1.1 对象
1.1.1 样品 来自广州市妇婴医院，收集105名健康成人、93例经常规地贫筛查有阳性表型的连续临床样品。每例抽取外周血2ml，EDTA抗凝，共198人(其中男性95人，女性103人，年龄20～55岁)。所有样品均做血细胞分析及常规血红蛋白电泳分析，红细胞指数正常[平均红细胞体积(MCV)≥85fl,平均红细胞血红蛋白(MCH)≥28pg]且血红蛋白电泳正常(2.5%≤Hb A2≤3.5%且无其它异常带)者视为正常，共105名；红细胞指数表现为小细胞低色素(MCV<85 fl,MCH<28 pg) 且血红蛋白电泳异常(Hb A2<2.5%或Hb A2>3.5%,有其它异常带)者视为异常，共93例。
1.1.2 常规血红蛋白电泳材料 碱性血红蛋白电泳试剂盒(Spife Alkaline Hb-400，REP Electrophoresis kit)为美国Helena Laboratories公司产品。
1.1.3 毛细管电泳材料 CE-Sure Haemoglobin(Hb) kit为美国Helena BioSciences公司产品，NaOH，H3PO3为国产分析纯试剂。
1.1.4 基因分析材料 引物，探针(序列见参考文献8，9,10)由上海博亚生物技术有限公司合成，带正电荷硝酸纤维素膜为Pall Support公司产品，dNTP为宝生物工程(大连)有限公司产品，Taq DNA聚合酶为北京鼎国生物技术发展中心产品，TMB(3,3’,5,5’-Tetra- methylbenzidine)为美国Fluka公司产品，Streptavidin-POD(Streptavidin -Peroxidase)为德国 Roche公司产品。
1.2 方法
经表型和基因型鉴定未发现异常的正常样品,做CE分析，测其Hb A2的含量，经统计学处理后得到成人Hb A2的正常参考值。异常样品用CE分析Hb A2的含量，参照所得到的成人Hb A2的正常参考值做出判断。然后对异常样品进行基因型分析,以验证CE诊断地贫的准确性。
1.2.1 血红蛋白电泳分析 采用常规琼脂糖凝胶电泳，在Spife combo电泳仪(美国Helena Laboratories公司产品)上完成。
1.2.2 CE分析 吸取5l全血或红细胞与40l红细胞裂解液混合，完全溶血后与200l甲基纤维素工作液(含0.05%甲基纤维素的水溶液)混匀，进样于荷兰PrinCE 1-lift system(Prince Technologies, Netherlands)型毛细管电泳仪，采用等电聚焦毛细管电泳法进行分析，所用毛细管为涂渍石英毛细管(73cm×75m i.d.,有效分离长度为55cm，美国Helena BioSciences公司产品)，阳极液为含0.05%甲基纤维素的105mmol/L的磷酸溶液，阴极液为含0.05%甲基纤维素的21.88mmol/L的NaOH溶液, 两性电解质工作液为含0.05%甲基纤维素0.05%的两性电解质溶液。电泳参数为：100mPa×0.08min压力进样，样品在25℃、恒定压力15mPa、恒定电压20kV下运行10min。用HPLC- spectrophotometer LAMBDA　1010(BISCHOFF Analysentechnik und –geräte GmbH Leonber,　Germany)于波长415nm检测，数据采集与分析采用DAx with WinVolt Data Acquisition and Analysis Software (Van Mierlo Software Consultancy, Netherlands)软件完成。
1.2.2.1 成人Hb A2正常参考值的测定：经血细胞分析、血红蛋白电泳和基因型鉴定均正常的105名成人(其中男性60人，女性45人，年龄22～45岁)样品，通过CIEF测定其Hb A2值并做统计学分析。
1.2.2.2稳定性和精确性的测定：取1份正常样品，一份Hb A2升高的样品分别于采血第2、4、6天测定Hb A2值，每份每天重复测定10次,通过计算Hb A2的迁移时间及Hb A2含量的CVs值评价CIEF测定Hb A2的稳定性和精确性。
1.2.2.3与常规检测方法的对比：将CIEF分析结果与上述临床常用的常规血红蛋白电泳所得结果进行对比，观察CIEF与临床常规分析结果的符合率。以样品的基因型为标准，与CIEF分析结果进行对比评价CIEF检测Hb A2在-和-地贫携带者筛查中的准确性和可靠性。
1.2.3 基因分析 常规酚-氯仿法提取样品的白细胞DNA，用PCR法[8、9]，及PCR结合反向点杂交法(PCR-RD[10]对样品进行基因型分析。
1.2.4 统计学分析 实验数据的分析采用SPSS　11.0统计软件(美国SPSS公司产品)进行分析。
2  结果
2.1 成人血红蛋白CIEF分析图谱：图1为正常成人、成人-地贫携带者、成人-地贫携带者和成人血红蛋白E病例的典型CIEF图谱,从图谱中峰的位置和Hb A2的峰面积大小可以大致将以上几种类型区分开来(数据未列出)。

图1　不同类型的血红蛋白病毛细管电泳图谱(见附件)
2.2 基于CIEF的Hb A2的正常参考值的测定： 105名正常成人Hb A2检测值的统计学分析表明：该组数据的频数分布服从正态分布(P=0.200>0.05) (图2)，Hb A2检测值的范围为3.39%～5.90%，平均值为4.41%，标准差为0.42%，95%可信区间为3.59%～5.23%(图2)。按性别分组后做统计学分析，两组数据方差齐(F=0.61,P=0.44>0.05)且差异无显著性(t=1.16,df=103,P=0.25>0.05)，表明无性别差异。
图2　CIEF测定105份正常成人样品Hb A2值的频数分布情况(见附件)

图3　正常成人、-和-地贫Hb A2　CIEF测定值分布情况(见附件)
2.3 稳定性和精确性的测定：两例样品(Sample 1,Sample 2)各自的三天重复(60次)CE检测结果显示：Hb A2的平均出锋时间为288.49s,s=13.49, CV为4.67%。定量测定Hb A2CVs见表1。定量测定正常样品(Sample 1)的CV为： 3.63%～9.04%；Hb A2升高样品(Sample 2)的CV为：2.75%～5.09%。
表1　CIEF测定Hb A2精确性
Table 1 Precision of Hb A2 measurement by CIEF

  N  Mean,%  s  CV,%
Sample 1       
Day 2  10  3.65  0.33  9.04
Day 4  10  3.86  0.14  3.63
Day 6  10  3.74  0.18  4.81
       
Sample 2       
Day 2  10  7.66  0.39  5.09
Day 4  10  7.65  0.21  2.75
Day 6  10  7.37  0.31  4.21

2.4 CIEF与常规血红蛋白电泳的比较：通过对198份样品的常规血红蛋白电泳和CIEF Hb A2测定值做统计学分析，可见常规血红蛋白电泳(Conventional Hb electrophoresis, CHbE)Hb A2测定值相对于CIEF Hb A2测定值之间的的线性回归方程为Hb A2 CHbE=-2.707+1.321Hb A2 CIEF，相关系数为0.991(图4)，显示出二者之间良好的线性关系。
图4　CIEF与常规血红蛋白电泳测定Hb A2的线性关系。(见附件)
2.5 样品的基因型分析结果：CIEF诊断为-地贫的43例携带者中，经基因分析其中42例的基因型为--SEA，例为；CIEF诊断为-地贫的44例携带者的基因型为: CDs41/42(-TCTT)/N 18例，IVS-2-654(C→T)/N 13例，-28(A→G)/N 6例，CD17(A→T)/N 4例，-29(A→G)/N 1例，CD43(G→T)/N 1例，CDs71/72(+A)/N 1例；诊断为Hb E的6例携带者的基因型均为CD26(G→A)/N。