主题：【原创】带你解析HPLC--定量

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xiongbb

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发表于：2012/01/09 11:46:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

hplc 主要作用之一是定量分析，可以用于对目标物的定量，当然目标物可以是1种或者多种。不过这些都基于好的hplc方法。包括很好的精密度、准确度、线性等等，具体可以参照http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120102/3773011/的定义介绍。

当然hplc定量范围有限，取决于灵敏度这些。Ppb级别或者ppt级别等等，不同的检测器可以定量的级别不同。不是特别懂质谱检测器，就不评论了。不过公司新入手ab4000，还没研究明白。

（=我鼓捣明白了，来个.....）

1、准确度、精密度、线性范围、检测限、定量限

看上面网址的介绍吧。

这里提一下最大定量限：是指用该方法能够可靠测定的最大浓度。通常由检测器的线性范围决定。

2、噪音

这个很常见了，也是经常出问题的地方，具体指没有被测物的情况下基线信号值得不稳定程度。

分为短期噪音，主要原因包括检测器噪音，泵脉动，几分系统噪音。

长期噪音，主要原因有流动相组分在线混合不均匀；温度；样品污染；

基线漂移，这个原因就复杂多了。梯度的影响，检测器，温度等等；

在这里建议大家使用hplc的时候，必配柱温箱、在线脱气、在线过滤；定期对仪器做维护。避免分析过程中对定量产生影响。

3、峰高和峰面积

测定检测器对一化合物的最简单方式是测定其信号峰的高度，对于痕量分析较好。对分离良好的单一组分，峰高是基线到峰顶点间的距离，其中基线值为峰开始前至结束后的平均值。

峰面积是hplc中最常见的定量方法，这个计算方法分3种：

a 峰高*半峰宽

b 三角形法

c 数据系统计算

如果对比峰高和峰面积定量准确度，对痕量分析来说峰高更适合，更准确；

由于痕量物质存在，被测物分离不完全，会影响峰面积定量。因此常常采用峰高来定量。

4、定量方法

1)、面积归一化法

完成一次运行并对色谱图中所有有意义的峰进行积分后，便可计算出总的峰面积。

2)、外标校正法

确定未知样品浓度的最常用方法是用外标物质做校正曲线。这个大家都太熟悉了，就不多介绍了。

在做标准曲线的时候，需要注意色谱条件的恒定。现在很多仪器都内置了这个模块，自动进样，自动生成标准曲线。

3)、内标校正法

内标校正法，在校正溶液和样品溶液中加入内标物，内标是不同于被测物的化合物，但在分离中能与被测物良好的分开。使用内标的主要原因在于校正样品在制备、预处理、衍生、过滤、萃取等过程中的损失。

内标法中校正曲线通过制备并分析不同浓度的样品溶液其中加入相同浓度的内标物质的校正液得到。

适宜的内标物要求包括：

a 能与被测物以及杂质峰很好的分开

b 与被测物有相似的保留值

c 原样品中不存在

d 在样品制备步骤中与被测物质性质相似

e 化学性质上不必与被测物质相似

f 可得到高纯的标准品

g 稳定，不与样品以及流动相反应

h 与被测物具有相似的检测器响应

对于复杂的样品，尤其是基质比较复杂的样品，（我曾经接触过药物代谢方面的工作），最具挑战性的要求是内标物必须与所有分离中的有关化合物分开。

4)、标准加入法

理想的校正标准应该在空白基质中制备，以对实际样品提供最好的校正。所以，不含药物的药物制剂空白基质或不含添加剂的动物食品通常可用走标准校正溶液。不过在某些情况下，不可能制备具有代表性的标准溶液，即它含有被测物。例如血清中胰岛素；这种情况下，标准品加入法为定量分析提供校正曲线。

标准品加入法用于痕量分析最对，将不同重量的被测物加到样品基质中，开始时在基质中即已含有未知浓度的被测物，将标准加入的校正品浓度响应值的曲线外推至零浓度，即可定义出添加样品时的初始浓度。