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主题：【分享】键合相对色谱行为的影响

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发表于：2012/03/09 20:36:18 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、容量因子和表面覆盖率的关系

在相同的洗脱条件下，给定溶质在分子柱子上的容量因子随键合相的表面覆盖率的提高而加大。如果想得到较高的溶两银子，应选择覆盖率较高的键合相填料。由于键合相配基的分子体积大小相差很大，因此，由于位阻效应，随分子体积的加大，其在硅胶表面上的键合率也会相应的降低。对于常见的反相填料，特别是C18反相填料，其配基的密度一般在3.0-3.2umol/m²,最佳值约在3.1umol/m²左右

2、链长对容量因子的影响

容量因子和正烷基链中的碳原子数有相当好的线性关系。在以相同的淋洗条件时，溶质的保留能力随链长而增加。当然，当配基的键合密度相同时，链长的增加意味着配基所具有的表面积更大，因而有更强的缔合作用。因此，碳含量只是链长增加的表证而非保留增加的起因。

与链长有关联的一个问题是配基的化学结构，由于可用单氯、二氯及三氯硅烷来合成反相填料，所以，同是C8或C18,它们的配基结构是不同的。研究表明，相同的淋洗条件下，单氯型〉二氯型〉三氯型，这其实也是疏水性的微小的差异所导致的结果。

3、反相填料的选择性

反相填料的选择性取决于填料表面的物理、化学特性。影响选择性的主要因素有：配基的种类与数量；硅胶基质的纯度，即杂质的种类与含量以及表面残余硅羟基的浓度。不同的填料，往往表现出不同的选择性。

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2012/3/17 12:13:14 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。

1．键合相的性质

目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm²，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应。

残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。

由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同，因此具有相同键合基团的键合相，其表面有机官能团的键合量往往差别很大，使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。

pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响，一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。

2．键合相的种类

化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。

常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH₂)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。

常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。

另外C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。

　A填料基质

　　硅胶基质：纯度高成本低，强度大，化学修饰容易，但pH值范围有限。大多硅胶基质填料在pH2-8之间稳定，但经过特殊修饰的硅胶键合相可以稳定在pH1.5-10。

　　聚合物基质：应用pH值范围宽，温度稳定(高温可以达到80度以上)，机械强度小。

　　B颗粒形状

　　大多现代HPLC填料都是球形颗粒，但有时是不规则的颗粒。球形颗粒提供较低的柱压、较高的柱效和稳定性以及较长的柱寿命在使用高粘度的流动相时;不规则颗粒有较大比表面积和相对低廉的价格。

　　C颗粒粒径

　　粒径越小柱效越高、分离度越高，但同时会导致较高柱压降。选择1.5-3µm的填料以解决一些复杂样品,UPLC可以使用1.5µm的填料;另外10µm或更大粒径的填料用作半制备或制备柱。

　　D 含碳量

　　含碳量指的是硅胶表面键合相的比例，与比表面积和键合覆盖度等有关。高含碳量提高柱容量、分辨率及分析时间，用于要求高分离度的复杂样品;低含碳量分析时间短、展现不同的选择性，用于快速分析简单样品及需要高含水流动相条件的样品。一般C18的含碳量在7-19%不等。

　　E孔径和比表面积

　　HPLC吸附介质是多孔的颗粒，绝大多数的反应表面于孔内。因此，分子必须进入孔内才能被吸附和分离。

　　孔径和比表面积是相辅相成的两个概念。孔径小比表面积大，反之亦然。比表面积大，增加样品与键合相之间的反应，增加保留,上样量和复杂成分的分离度;比表面积小，平衡时间快，适合梯度分析。

　　F孔容和机械强度

　　孔容，又称“孔体积”。指单位颗粒的空隙体积大小。它能很好的反应填料的机械强度。孔体积大的填料相对孔体积小的填料机械强度要略弱。孔体积为1.5mL/g 或更小的填料大多用于HPLC分离，而孔体积大于1.5mL/g 的填料使用于尺寸排阻色谱和低压色谱。

　　G封端封端

　　封端能够降低极性碱性化合物因为与裸露的硅醇基相互作用而产生的拖尾峰。不封端键合相相对封端键合相会产生不同的选择性，尤其是极性样品。

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2012/3/17 12:25:53 Last edit by gl19860312

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2012/3/17 12:23:47 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

　　色谱填料分类(键合相)

　　1 s硅胶柱

适用于能溶于有机溶剂的低分子量化合物的分离。硅胶柱上的分离与样品中化合物的官能团方位、类型和数量有关。在制备色谱技术中，正相色谱技术有很大优势，因为纯化以后的样品只需要蒸发掉溶剂即可得到纯净化合物，不象反相色谱那样需要费时的冷冻干燥。

　　2 ODS/C8/C4等反相柱

　　ODS使用单官能团键合剂在优化的条件下达到高密度键合覆盖率的一种十八烷基键合相硅胶吸附剂，耐用的小分子HPLC柱，，C18柱常和水/甲醇或者水/乙腈流动相结合使用，对于疏水性不同的小分子，蛋白质和肽类等，具有出色的分离能力。C8与C18色谱柱相同，也是靠疏水性相互作用的机理分离样品，但是保留能力减弱。当样品极性太强或者疏水性太强而无法在C18柱上进行色谱分析时，C8柱是一个很好的选择。一些极性化合物在C8柱上能有更好的表现，由于C8键合相良好的表面覆盖率，像维生素、抗生素和碱性药物通常在C8柱上的分离要比C18柱好，而且峰形更加对称。

　　3 NH2

是一种氨丙基键合硅胶吸附相，既能用于正相分析，又能用于反相分析。氨基固定相的选择性与C18相比，有很大差别，使得它对那些极难分析的极性化合可以达到理想的分析结果。另外，氨基柱与离子凝胶柱相比，对糖类化合物表现出更高的分离效率。此类应用中的典型流动相是乙腈/水。在正相模式下的分离类似于未键合的硅胶，但是梯度平衡的时间更短，寿命更长。

　　4 二苯基

　　适用于含有双键和芳香基团的化合物。与C18和苯基已烷键合相相比，不是依靠疏水保留机理，二苯基键合相主要是依靠化合物的π-电子结构的不同来获得分离。如果您需要在分析中提高芳香族和双键化合物的选择性，提高分离度以及提高样品通量。

　　5氰基柱

　　氰丙基键合硅胶吸附相，它的独特之处在于能同时用于正相和反相分离模式。当使用含水的有机流动相时，分析物的洗脱顺序和反相模式一致：极性化合物洗脱快，非极性化合物则被更多的保留。因此氰基柱可以分析那些对C18柱来说疏水性太强而且在有机溶剂中溶解性不好的化合物。氰基柱作为正相柱使用时，分离化合物的原理是基于极性相互作用。