河北医药 Hebei Medical Journal 药品检测

2004年1 月第 26卷第1 期, Jan 2004 , Vol 26 No 1

随着氨基酸的广泛应用 ,对氨基酸的检测分析水平也不断提高。目前 ,氨基酸含量检测主要应用氨基酸自动分析仪和HPLC。随着 HPLC 的发展 ,使用高效液相色谱技术分析氨基酸获得迅速发展 ,由于 HPLC技术无需特殊反应装置 ,具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点 ,已在许多实验室部分或全部的代替了氨基酸自动分析仪 ,广泛应用于多种生物样品内氨基酸的检测。HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。

实验所用色谱柱常采用 C18柱、C8柱以及CN 柱 ,检测器使用紫外、荧光或电化学[1] 。流动相常采用强极性溶剂 ,如水、乙腈、甲醇以及磷酸盐缓冲液。不同种类、不同离子强度的缓冲液均可影响到氨基酸容量因子 ,此时缓冲液的 pH值对容量因子的影响不大,但应注意当 pH<2或pH>7 对柱固定相有裂解作用。洗脱一般采用二级或三级梯度洗脱方式 ,洗脱程序明显影响分离效果

邻苯二甲醛(OPA)

OPA是目前氨基酸测定中使用最广泛的一种衍生剂 [2]。OPA与氨基酸的衍生化反应 ,需 y- 巯基乙醇为还原剂 ,浓度高于氨基酸浓度200倍 ,反应介质pH以 9.5一10.0 为宜 ,此反应 2min内即可完成 ,8min时大部分氨基酸荧光强度减弱。由于 OPA衍生化反应不稳定 ,受反应时间、反应温度以及光线的影响 ,因此应严格控制反应条件,以获得较好的重复性。反应完毕立即进样[3]。

加人四氢吠喃 ,将有助于苏氨酸和甘氨酸的分离。〔,此法最大的缺点是不能与具有亚氨基的氨基酸反应 ,例如脯氨酸、羫脯氨酸

刘建芳,侯艳宁,刘会臣 . 柱前衍生一电化学检测 HPLC法测定大鼠脑内的谷氨酸和一氨基丁酸。解放军药学学报 , 2000,16，299

陈柏林 ,郭敏,陈利娟 HPLC Pico-tag 法分析人胎盘的氨基酸成分.营养学报,1996,18,480

陈日来 ,陈得光 ,任斌,等 RP-HPLC法测定正常人血浆中14种氨基酸华西药学杂志 1999

14:159

反相高效液相色谱定量分析多肽中的氨基酸组成

吕　艳 , 冯凤琴

浙江农业科学 2006年第2期

　　氨基酸的组成分析是多肽 (蛋白质) 化学研究中最基本的内容之一。通过氨基酸组成分析可以初步了解多肽 (蛋白质) 的化学结构特点 , 以及某些特征活性氨基酸的分布情况 , 对多肽 (蛋白质) 结构与功能的研究提供科学的信息。

氨基酸含量检测主要应用氨基酸自动分析仪和高效液相色谱 (HP LC) 。随着 HP LC的发展 , 使用HP LC技术分析氨基酸获得迅速发展 , 由于 HPLC技术无需特殊反应装置 , 具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点 , 已在许多实验室部分或全部代替了氨基酸自动分析仪 , 广泛应用于多种生物样品内氨基酸的检测。

HPLC分析原理主要是利用氨基酸中的氨基与标识化试剂作柱前或柱后衍生，在色谱柱内层析，再进行测定【3】HPLC的氨基酸分析方法又有许多种，目前最高效、文献报道最准确的方法就是柱前衍生反相高效液相色谱法。但仅用于反相高效液相色谱检测氨基酸的柱前衍生试剂就有近十种。

[3]郭健，肖飞，唐志毅．高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸．中华检验医学杂志，2000，23(4)：217

　由于酵母发酵液中含有近二十种氨基酸 ,故本法采用二元梯度洗脱程序分离氨基酸。在氨基酸分离过程中 ,通过调节流动相A 和B 的相对浓度比值 ,改变流动相的 pH值 ,使得发酵液中各种氨基酸按照先酸性、后碱性的顺序先后被洗脱出来 ,而且分析周期短、分离效果好。在分离后期全部切换成流动相 C ,目的在于再生离子交换高效液相色谱柱。

OP A柱前衍生法用于高相高效液相色谱分析氨基

邹安珍孙自勇

安徽大学学报（自然科学版） 1991年3期

蛋白质、多肤的氨基酸组成分析，一般采用经典的离子交换色谱、茚酮或荧光试剂的柱后衍生法。这种技术对大多数氨基酸有较低的检测下限，尤其是用荧光胺和OPA作为柱后衍生试剂〔1〕但需要特殊的仪器，而且分析时间较长。

本文采用柱前衍生法。在一SH存在下，OPA能与伯氨基反应，产生具有高荧光强度的异吲哚衍生物2】这些衍生物用反相高效液相色谱法(RP一HPLC)分析，具有选择性强，灵敏度高，方法简便，不需要特殊仪器等优点 34

不足之处是，OPA只能与伯氨基反应，而对亚氨基脯氨酸不反应，因而需要在衍生反应前将脯氨酸转变成一级胺来补救【8

其次是OPA一Lys衍生物不稳定，不易做定量分分析

ROBERT .CUNICO And IMSCHLABACH .Chromatogr.，266，461(2985)

鲁子贤等.蛋白质和酶学研究方法.科学出版社.1989

OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量

牟德海

(广州分析测试中心广州 510070)

第15卷第4期 Vol.15 No.4

色谱 CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY

1997年7月July 1997

提要建立了邻苯二甲醛(OPA)手动柱前衍生反相高效液相色谱法测定样品中氨基酸含量的方法。以邻苯二甲醛(OPA)/3-巯基丙酸(3-MPA)为衍生试剂进行衍生,ODS柱分离,340nm检测,在40min内18种氨基酸全部得到基线分离。

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氨基酸的高效液相色谱分析

朱曙东赵异皓

第12卷第1期 1994年1月色谱

Vol.12No.l January1994

氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之一。1958年，Spacman等〔1

2〕首先介绍了用离子交换色谱与柱后荀三酮衍生结合的方法分析蛋白质水解生成的氨基酸，同时提出了构建氨基酸自动分析仪的细节，建立了传统氨基酸自动分析技术。其后，传统氨基酸分析随着衍生方法、柱载体化学、高效液相色谱(HPLC)仪器学的迅猛发展，分析速度、灵敏度和自动化程度不断提高〔3〕。近十年来，反相高效液相色谱(RP一HPLC)与各种柱前衍生相结合的氨基酸分析技术发展迅速，显示出各自特有的优越性，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。

OPA衍生法产生于1971年〔8可能是目前应用最广泛的氨基酸柱前衍生方法。OPA与琉基试剂，通常是与琉基乙醇(月一MCE)连用，在碱性条件下与一级胺反应迅速(30s

产生荧光产物1一琉代一2-烷基一异吲哚“:、一34onm，棍M=45onm)〔，〕。衍生物很适于HPLC分离

声一MCE作疏基试剂时Asn/Ser、val/Met分辨率较差10】〕，近来有用3一琉基丙酸(3一MPA)替代它，借引入一个a一羧基.使这两对氨基酸衍生物疏水性相对减弱，再用乙睛替代甲醇，即可使其完全分离11】

1 Spackman DH，Stein WH，MooreS.AnalChem.1958:30:1185

2 Spackman DH.Srein WH.MooreS.AnalChem，1958;30:1190

3 HirsCHW.Methods一nenzymology(Vol.gl).NewYork:AedemiePress，1983:3

. 8 RothM. AnalChem，1971;43:880

9 Halawal.BalgS，QureshiGA.BlomedChromatogr，1991;5:216

10 HayashiT，TsuehiyaH，Naru，eH.JChromatogr，1982;274:318

11 GraserTA，GodelH，Albers5ftal.AnalBloehem，1985:151:142

氨基酸的柱前衍生高效液相色谱分析述评

蒋新宇　周春山　　(中南工业大学　长沙　410083)

第29卷第2期 19 99年4月　

湖　南　化　工HUNAN CHEMICAL INDUSTRY

Vol.29 No.2April 199

2　邻苯二甲醛(OPA)衍生法

邻苯二甲醛(OPA)衍生法具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定的特点。因此,它在柱前衍生试剂中应用最广泛。在巯基试剂,通常是2-巯基乙醇存在下, OPA与一级胺迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚。衍生物经HPLC分离后既可对其进行高灵敏度荧光检测,又可进行一般的紫外吸收检测。紫外检测灵敏度可达1×10-12mol水平;荧光检测灵敏度可达1×10-15mol的水平。2-巯基乙醇作巯基试剂时,天冬氨酸/丝氨酸、缬氨酸/蛋氨酸的分辨率较差,现已用3-巯基丙酸(3-MPA)代替,同时采用优化梯度程序使其得到完全分离[1]。

OPA柱前衍生HPLC法比传统柱后衍生法有更高的分辨率和灵敏度。多数氨基酸检测极限为0·5×10-12mol,只有组氨酸和赖氨酸较高,分别为2·5×10-12mol和3·5×10-12mol。

OPA法的主要缺点有:①不能与二级氨基酸直接反应,因此作全谱分析时需配以其它技术;②OPA的氨基酸衍生物不稳定,特别是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快,因此此法多用于全自动的在线分析。

1 牟德海·OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量[J]·色谱, 1997, 15(4): 319~321

2邻苯二甲醛(OPA)衍生氨基酸HPLC方法发展

自上世纪70年代Roth[52]提出OAP衍生氨基酸反应替代茚三酮后，Lindroth[53〕、Hurst[54]、Elkin[56]先后对OAP衍生氨基酸进行了系统分析和考察，并与传统的离子交换法进行了比较。近年来，OAP衍生氨基酸以其反应迅速、设备要求低、操作简单的特点得到广泛应用。但氨基酸的OAP衍生产物稳定性差，准确定量难，大大影响方法的进一步发展。

2.24流动相pH值对分析的影响

当分析酸性或碱性样品时，加入缓冲剂控制流动相的pH是非常可取的。常规用pH计很难精确测定含有有机溶剂的流动相pH，因为电极响应易发生漂移。因而，如使用pH计，最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂[10l]。

225衍生物比例对分析的影响

在常规的衍生反应中，衍生试剂都是过量的。根据反应平衡的原理，衍生试剂过量越多，反应越完全，定量越准确。对于实际样品的分析，并不是衍生试剂过量越多越好，应该选取一个不仅能使被标记物反应完全，又能减少衍生试剂用量的比例，因为大多数衍生试剂都较为昂贵、且有一定毒性，还可能对分析造成影响。OPA虽然不存在过量试剂产生干扰峰的问题，但衍生化溶液中还原剂琉基乙醇毒性大、有臭鸡蛋味，应控制用量。

2.26衍生反应时间对定量分析的影响

通常一个反应需要一定反应时间才能达到完全反应；而衍生产物也存在稳定时间的问题。因此，衍生反应时间对于样品响应值有着显著影响。据文献报到[53，54]，OAP衍生氨基酸产物稳定性较差。

52 Roth M. Fluorescence reaction for amino acids. Analytical Chemistry.1971，43:880-882

53 Lindroth P, MopperK. High Performance liquid chromatographic determination of subpicomole amounts of amino acids by precolumn fluorescence derivatization with o-phthaldialdehyde .Analytical Chemistry.1979，51(11):1667-1674

54 Hurst W J，Martin R A. Use of o- phthaldialdehyde derivatives and high-Pressure liquid Chromatography in determining the free amino acids in cocba beans. Journal of Agriculture Food Chemistry.1980，28:1039

56 Elkin R.G Measurement of free amino acids in avian blood serum by reverse一Phase high一Performance liquid chromatography as compared to ion-exchange chromatography. Journal of Agriculture Food Chemistry.1984，32:53-57

101 Rose’s M .Determination of the PH of binary mobile phases for reversed-phase liquid Chromatography Journal of Chromatography A.2004, 1037:283-298

样品的预处理:取适量发酵液离心(12000rpm，10min)，取250yL上清，加入1mL的甲醇，振摇至匀，静置15min，离心(12000rpm，10min)，取1mL上清，80℃水浴蒸发至干，4℃保存。

氨基酸分析的检测方法评述

戴红 ,张宗才 ,张新申

(皮革化学与工程教育部重点实验室(四川大学) ,四川成都 610065)

第14 卷第3 期　　　皮革科学与工程 2004 年6 月

摘　要:对氨基酸分析常用的化学方法、电化学方法、分光光度法(包括可见光分光光度法 ,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等检测方法进行综述 ,以期为提高氨基酸分析的灵敏度、准确性 ,为快速、高效的氨基酸分析方法的建立提供参考。

氨基酸分析 ,按分离方法分可分为纸色谱法、离子交换色谱法、反相高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法等;按检测方法分可分为化学分析法、电化学方法(包括电导检测、安培检测) 、分光光度法(包括可见光分光光度法 ,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等;按衍生反应的先后 ,可分为柱前衍生和柱后衍生法。由于氨基酸是一类化学性质相似的生物活性物质 ,在分析过程中 ,检测方法的灵敏度对分析的准确性起非常重要的作用

3. 2. 1 　OPA(邻苯二甲醛 —疏基乙醇)法

早在 1971 年. Roth[13 ]就提出了 OPA 衍生法.由于其灵敏度比茚三酮法高出 10 倍 ,故最初作为一种柱后衍生剂 ,Jones等[14 ]提出的衍生方法如下;

OPA在 2 一巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅速反应生成 1-硫代-2-烷基异吲哚加成物可产生荧光 ,在紫外区也有较强吸收。它可用高灵敏度荧光检测 ,又可采用一般的紫外吸收检测。紫外检测波长为 350nm ,紫外检测线性范围为 1 ×10 - 11～20× 10 - 11mol。OPA 本身不干扰分离与检测 ,不必除去过量试剂 ,色谱图基线也比较平稳[11 ]。

OPA与氨基酸的衍生化反应需要在碱性环境下进行 ,早先用加有 0. 4mol/ l 的硼酸盐缓冲液(pH= 10. 4)来提供碱性环境。由于疏基乙醇带有强烈的气味.因此改用巯基丙酸来代替它。后者和前者作用相同且气味较小 ,具体试验条件如下:精称

100mg邻苯二甲醛 ,加 100ul 琉基丙酸 ,用 10ml 的0. 4mol/ l 的硼酸盐溶液溶解 ,得衍生化试剂。按 1 :1 的比例和样品溶液混合 ,过滤 ,立即注入高效液相色谱仪进行分析 ,因衍生化后的样品不稳定 ,久置后误差较大。如果要分析脯氨酸.因其是二级氨基酸 ,需用 9 —芴基甲酰氯(FMOC)进行衍生化[15 ]。

OPA 最大的缺点是: (l)不能与带有仲胺基团的脯氨酸或羟脯氨酸反应.因此做氨基酸全谱分析时需配以其它技术(如与 FMOC等衍生剂一起使用) 。(2) OPA 的氨基酸不稳定 ,特别是甘氨酸 ,赖氨酸衍生物的信号衰减很快 ,此法多用干全自动的在线衍生。

[11 ]傅亮 ,倪冬姣 ,张水华.氨基酸高效液相色谱分析[J ] .仲恺农业技术学院学报 ,1994 ,7 (2) :77 - 82.

[13] Roth M. Analysis of protein reversed phased luquid chromatography [J]. Analytical Chemistry, 1971, 43:880.

[14]Jones B N, Gilligan J P. Molden analysis methods of amino acid [J]. Journal of Chromatography, 1983, 10:266 - 271.

[15 ]蒋新宇 ,周青山.氨基酸的柱前衍生高效液相色谱分析述评[J ] .湖南化工 ,1999 ,29 (2) :9 - 11.

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高效液相色谱测量啤酒中氨基酸

吕丽

（牡丹江白酒厂，黑龙江牡丹江 157000）

第23卷第4期齐齐哈尔大学学报

2007年7月

摘要：本文建立了测量啤酒氨基酸的有效方法，该方法使用高效液相色谱采用梯度洗脱测定啤酒中的氨基酸，结果回收率为 99.2%，RSD为 2.01%，表明本方法精密度高，稳定性好，可作为检测啤酒氨基酸有效方法。

色谱条件

采用柱前 OPA、FMOC衍生化，梯度洗脱的方式进行色谱分析；色谱柱:ODS Agilent 250×2.6mm；紫外检测器波长: 338 nm；流动相：A相 0.02 mol/L无水醋酸纳溶液用三乙醇氨和冰醋酸溶液（1.5%）调 pH至 7.20，加 2.85 ul四氢呋喃（0.5um过滤），B相 0.1mol/L无水醋酸纳溶液 200ml 调 pH 至 7.20,然后加 200 ml -甲醇，200ml 乙腈（0.5um 过滤）；流动相配比：0-16 min 100%A相，16～17 min 40%A相 60%B 相，17～25 min 100%B 相；流速：1 ml/min；柱温：20～25℃

回收率实验

取 10 ml容量瓶，精密加入对照品溶液 50 ul及啤酒 1ml，加水稀释至刻度，摇匀作为供试品 A；精密移取啤酒 1ml，置 10ml容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀作为供试品 B，用供试品 A含量减去供试品 B含量，测得其回收率分别为 99.5%，99.2%。

高效液相色谱法测定江米甜酒中游离氨基酸的含量

朱显峰，杨生玉，张彭湃

食品科技检测技术 NO.1 2005

高效液相色谱法快速测定啤酒中氨基酸

陈　平　刘耘畦

(1.池州师专化学系　247000 　2.昆明理工大学生物工程及化学工程学院　650093)

第 17 卷第 3 期池州师专学报 2003 年 6 月

[摘　要] 　用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法快速测定啤酒中十五种氨基酸的含量。该办法测氨基酸快速 ,简单 ,灵敏度高 ,重现性好。

(二)色谱条件

色谱柱 WATERSODSC18 150 ×39mmi . d ; 柱温:34 ℃;流速: 1. 1ml/ min ;荧光检测器; Ex = 360nm , Em =450nm;流动相:相 A 为 0. 2M 醋酸纳缓冲溶液 , PH = 6.50 ;相 B 为甲醇;梯度程序 ( T ,B %) , ( 0 , 20 %) , ( 22 ,80 %) , (24 ,20 %) (注: T 指梯度程序中的运行时间 ,B 指流动相B 的浓度) 。

(三)衍生试剂的配制:

称取邻苯二甲醛 0. 0500 克 ,用1ml甲醇溶解 ,加入 100ul 巯基乙醇 ,用 0. 4M 硼酸缓冲溶液(PH = 9. 5)定容至 10ml ,混匀 ,置于暗处每三天需重新配制。