主题:【分享】HPLC柱十大误区

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误区一:HPLC柱不可反冲

否。通常液相色谱柱的设计的耐压值远高于最大操作压力(大约2倍)。因此

,对于稳定的填料床,如果使用合适的流动相和合理的时间分配,填的好柱

子能够左右开弓。反过来使用HPLC柱的原因有以下几点:换柱时反冲,清洗

柱头强吸附的物质,以及冲洗出残留物质防止压力增大。

但是有一个特例,如果厂家在柱头使用了大粒度的填料,反冲会冲出这一部

分填料。通常而言,出口处的填料粒度要比整支柱子最小的还要小。比如标

称5μm的粒度,实际粒度在3-7μm,则出口处的粒度必须比3μm要小,这才

能够保证柱子末端的填料不会被冲出去。

那么为什么厂家要在入口和出口处使用不同粒度的填料呢?因为大粒度的不

容易堵,比如0.5μm的柱子比起同样2μm的柱子更容易堵塞。因此为了避免

压力的快速升高,就要生产出更加有容差,大粒径填料入口的柱子。

博主注:柱子能不能反冲从我一开始接触就遇到了,有时候不管能不能,若

是进过了脏东西,非要这样做不可,因为不可能让它沿着柱子跑一遍,费时

费钱。实际上,能不能反冲直接决定于填料床的模型和实际填料到底有什么

“添加剂”在里面,而这些资料waters,agilent,Phenomenex是不会给我们

的。经验表明,反冲效果最好的是菲罗门,手上的不论是luna还是Synergi,

都能够这样,其中一支更是创下了实验室反冲柱的神话–正过来寿终正寝,结

果反过来又起死回生,用了接近一半的寿命。

误区二:所有的C18(L1)柱都相同

否。早期HPLC体系中,C18是唯一的反向色谱的键合固定相,因此C18就作为

了反向色谱柱的标准并且许多先行者也乐于使用。因为医药工业最先采用

HPLC,并且管理机构也不愿意厂家搞出新花样。FDA和USP也给出了提交新药

品应用时设计的分析方法分类。给予了C18的HPLC柱子分类为“L”,因为C18

色谱柱大部分作为提交新药的方法柱,C18就成为了L1,就是第一个标准柱。

但更多的固定相出现,就以新的L值命名。(L7=C8,L10氰基,L11苯基)。

问题来了,因为商品化的C18合成条件不同,使用的不尽相同的作硅胶基体材

料,就导致了反向柱有不同的性能。比如说:有的厂家使用一氯甲基硅烷,

和小表面积的硅胶(如图),又有的使用同种硅烷,但是键合在大表面积硅

胶上。这样就会导致大表面积的更像C18。低键合相优势会有未反应的硅醇羟

基,能够导致混合的样品保留机理。所以厂商就使用二氯或者三氯硅烷,可

以使硅烷流动属性降低,键合相就会薄一些。而为了使没有反应完的硅醇羟

基消失,厂家就用小烷基封端来屏蔽(如三乙基氯硅烷)。硅醇基是中pH条

件下简单化合物拖尾的始作俑者。所以许多厂家使用了双封端技术,就是用

第二个小的硅烷来获得更加惰性的表面。厂家也使用了聚合物材料作为基体

,然后多多少少键合C18,这就导致了柱子C18总量参差不齐,但依然还是作

为C18(L1)来作为标准柱。也有的使用纯烷基硅烷键合,那么就表现出不同

的反应特性,提供了与氯硅烷不同的C18键合相条件。

所以呢,此C18非彼C18在今天看来特别有意义。龙生九子,子子不同,因此

用户分析开发的时候需要一致的柱子来获得稳健的方法。研究人员也开始研

究哪些C18有类似的保留特点和选择性。所以就发现有的C18便显出完全与C18

相反的特性。

博主注:只知道C18悠久,没有想到这么早,一般认为封端的就好些,比如大

连国产的那个,用着用着柱效下降很快,我就认为和这个键合啊,封端啊有

关系。

误区三:保护柱不影响分离效果

否。首先,配一个保护柱很好。如果固定相选择错误,保护柱也能够对分离

有效果。要明确的是:保护柱是保护分析柱避免被高残留的组分污染用的,

尤其是那些不想进让它柱子的部分。保护柱比起分析柱便宜许多,所以污染

的保护柱能够替换的更加勤。

理想的结果是,保护柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留强(如

高载碳量和混合相),就能够使得保留便宜而影响分离,甚至导致不同的选

择性。如果保留弱,问题就不那么明显,除非固定相影响整个体系选择性。

为了使保护柱最小化的影响分离,保护柱需要合适的装配。显然,保护柱安

插在进样口和分析柱之间,但是如果管路太长(太长或者内径太大),就会

造成额外的峰展宽,从而影响分离。系统引入整合保护柱,从以往的报道看

,基本上会达到分析柱的最佳水平。但是,整合保护柱基本上和卡式色谱柱

捆绑,因此不是那么流行。从操作的角度说,应当在不影响HPLC系统的前提

下容易卸下和更换。

理论上,如果保护柱延长了柱长,那么就对色谱分离有额外的塔板数。但就

像前面说的,保护柱要么在最佳条件使用,要么在最糟糕的条件下除去。所

以保护柱的优势就是延长柱寿命,而没有带来总体分析效率的提高。

博主注:最早接触保护柱,或者叫预柱,实在接触waters设备的时候,两个

圆圆的盖子,仪器标配,缺点是不锈钢管路还那么长,简单的保护部分被拉

出一大截死体积,后来菲罗门也送保护柱过来了,千把来块钱,一直放着也

没有用,说句实话,笔者不是很喜欢用这个做保护,原因就在于觉得影响效

果。

误区四:提高温度往往有利于分离效果

否。随着温度升高,流动相粘度下降,因此分析物传质速率提高,所以就能

够提供更好的色谱分离效果。正确,但是除了柱效,温度同样影响保留因子

(k)和选择性(α)。影响因素能够提高分辨率(其实这也是色谱分析最关

心的问题),或者降低分辨率。保留时间往往随着温度升高而降低,因为温

度作为一个热力学参数,使得高温度下分析物倾向于留在流动相中,会更快

的洗脱出来。但是,不同的化合物,也有可能对于温度有不同的保留程度改

变。以analgesics(一种镇痛药,译者注)为例,图二。这一系列的色谱图列

出了分析物在柱温20-90°C的情况。我们从中可以发现许多特点。首先,所

有分析物随着温度升高,保留时间减低且峰变窄,意味温度升高利于分离效

果。其次,salicylic acid(水杨酸即阿司匹林,译者注)在峰5,6之间,

随着温度位置改变较大。事实是在20-40°C时,该物质随温度变化,洗脱顺

序也发生了变化。所以,温度大于40°C会引起分离时间变短和洗脱顺序变化



当然,一个提高温度的好处在于降低了操作时的柱压,以便于使用更大的柱

流量和更细的填料。

另一个在高温下能够因此柱效的实验参数是流动相的热力学不匹配(互溶问

题,译者注)。如果柱子在60°C下操作,但是流动相在室温流入,那么进入

的较冷的流动相就能够引起峰变形,原因是不同温度下分析物会趋向在高温

的流动相中。所以建议大家使用恒温柱子的时候一定记得流动相要预热。

博主注:温度对出峰时间的影响是显然的,武汉这边的夏天热,液相色谱

这边一般都不愿意把门关上,所以空调以往这边吹,出峰就靠后,waters,

agilent 一般没有配柱温箱,varian,岛津的喜欢推广这个,对于稳定保留

时间很有作用。不过我觉得平常的实验室,流动相怎么放,色谱柱也怎么放

,不然就像上面说的,流动相里的分析物经不起温度的折腾。毕竟不论DAD(

PDA)还是UV测得是浓度,变形了测得就不太准了,0.15%很容易突破的。

误区五:碳载量越高,反向色谱柱就越好

否。谈到烷基键合相是,这样的结论肯定是对于链长、载碳量和表面积等有

概念误解。通常,真正的反向机理是,保留取决于分析分子的疏水性质,所

以保留一般取决于载碳量。载碳量越高,保留越长。载碳量一般与链长对应

,但有时候不是。典型的硅胶反应的硅醇含量在8.0 μmol/m2左右,用来键

合有机硅试剂。如果对于一个每平方米微孔相同的单层键合相,给定的表面

范围,链长越长,载碳量就越大,最终的结果是保留与链长一致。但是对于

短链键合相(比如C8),如果基体变面积大,那么键合的碳就会更多,就会

可能导致比C18更加长的保留。此外,厂家使用二硅烷和三硅烷,以及聚合物

基体也能取得较大的表面积,所以短链聚合相就会在这种情况下带来单联键

合所不具有的表面积。对比单体键合相,有时候上述的这些聚合物基体的键

合表层较薄,引起传质较慢。

高载量的反向柱更加容易坍塌和反润湿。对于这些柱子,当环境水样中的机

修饰剂降到10%的时候,类油的疏水固定相就会变得自我关联(self-

associate),而不是作为极性溶液(即相似相溶)。所以,在此情况下,高

碳载量理应并不利于反向色谱也不利于色谱重现性。

博主注:卖主子的公司都喜欢谈论这个指标,什么资生堂,迪马的柱子在介

绍的时候碳载量是放在显著的位置的。平心而论,碳载高的柱子制造难度大

,同时分析我手上小分子的时候还真是好些,目前还没有发现碳载高的柱子

塌掉的情况,可能做的还不够多吧。

误区六:使用小粒径的分析效果好

  否。对于一个装填优秀的色谱柱而言,随着装填粒径的减小,柱效提高

,但是如果附加柱(应该指保护柱,或者冗长的管路系统 译者注)对色谱系

统对谱带展宽影响足够明显,那么,色谱柱的粒径影响就不容易发觉。这些

附加柱效应影响列举如下:
1. 进样体积,包括进样环,以及进样阀的额外体积
2. 管路体积,包括从进样阀(器)出口到色谱柱入口
3. 保护柱的间隙和适配器
4. 在线过滤器体积
5. 色谱柱入口到色谱填料之间的一段距离的体积
6. 色谱柱间隙体积
7. 色谱柱色谱填料到出口的一段距离的体积
8. 色谱柱出口到检测器入口的管路体积
9. 检测器入口到流通池的管路体积
10. 流通池体积
  上述均为附加体积(就是死体积,介绍的比较全面 译者注)。因此,能

够做的就是把进样量最小化,保持色谱柱入口前的管路尽可能短,内径尽可

能小。如果色谱柱出口到检测器的管路合计1米长,内径0.5mm,谱带展宽就

会完全影响色谱分离效果。所以,想要在小于2μm或者1.0mmde 微孔柱上得

到好的效果,就要要保持“附加柱”尽可能的短。
  博主注:与其使用更好的柱子,还不如优化下色谱体系。每每

拿到柱子就看一下柱子验证报告,不论是国内厂商,还是老美,这个报告我

都是深信不疑的,如果拿了同样的标样做不出来,那最可能的原因就是系统

没有优化。人家出厂测试的时候,管路都是尽可能的短,尽可能的细,流动

相是尽可能的纯,没法比,但至少自己优化了比没有优化还是有区别的。

误区七:对于硅胶填料,硅醇基是拖尾的原因</strong>

  否。在特定场合,出现在硅胶基键合柱上的硅醇基,尤其是分析碱性化

合物,能够造成拖尾。拖尾的原因在于硅醇基团就是一个弱酸,pKa大约在

4.5和4.7之间。因此如果流动相pH值在4到5的时候,硅醇就会离子化,与正

电荷分子离子反应,比如通过静电作用于氨基的H反应(Si-O-----H-N 译者

注)。该反应可以通过减小pH到3阻止离子化来减小。但是对于许多碱性化合

物,在低pH条件下也能够发生拖尾。而对于碱性化合物的拖尾,要得到好的

峰形,就需要特别设计的反向色谱柱了。
  
三种原因能够造成拖尾,化学问题(之前已经讨论过),柱填充问题,

色谱设备硬件问题。三种问题都可以造成拖尾,但是要解决问题,就需要找

到问题的根源。详细的讨论需要千言万语,所以这里就只给出解决问题的大

概方向。首先,与硅醇基的反应问题,化学因素的拖尾能够用多种方式表现

出来。早期色谱柱,可以发现金属螯合剂能够和柱子中痕量金属反应。因此

,错误的进样溶剂就能够导致拖尾(-CN 螯合,译者注)。使用比流动相强

的溶剂进样也能够导致峰扭曲。(如甲醇配样,乙腈做流动相 译者注)。拖

尾还可能来自于柱头处,样品中不容易洗脱出的物质,和流动相的杂质。这

些物质能够与不同的固定相反应,然后在分析物经过的时候发生影响(杂质

占位,不保留 译者注)。流动相混合模式偶尔也能够诱发拖尾(应该指的是

四元单泵 译者注)。分析物与固定相作用,离子化合物与活性基体作用。有

时候,流动相pH错误,样品部分离子化,就能够导致峰扭曲和拖尾。此外,

色谱背景峰上的小峰,看上去也有点拖尾。
  
柱子的填充质量也可以导致拖尾。柱头的填料空隙可以导致分叉或者拖

尾。如果柱子没有填充好,有凹槽(可以是硅胶上的小洞, 译者注)就能够

因此峰形过宽。样品含量过大会导致拖尾(一般是后拖前不拖)。如果进得

少了,因为柱子上过度的硅醇反应,也能够导致拖尾。
  
第三个来讨论下仪器硬件问题。前面说的管路死体积(extracolume)和

接头体积能够导致拖尾。进样口的瞬间加压可以造成柱子和流动相之间的空

洞从而加剧拖尾。反应比较慢的检测器用来检测快速洗脱出的分析物时会形

成峰展宽和拖尾(和流通池厚度,长度有关 译者注)。前文中说的柱操作温

度和流动相温度不匹配自然也会引起。
  
所以,造成HPLC拖尾的不总是硅醇基。
  博主注:液相色谱天生的峰就宽,比不上GC或者电泳,看着就

羡慕,谁叫它是靠压力在水里走呢?柱子里走的路径不同,还有空隙里中间

快,靠边的慢,相比之下,就是正常的峰形,都觉得有些拖。把硅醇封端不

光是为了防拖尾,还有个作用就是防坍塌,用个小基团在C18、C8后面顶着,

柱子也耐用一些。

误区八:硅胶填料只能够在pH2到7使用
  通常有两种HPLC反向柱的化学退变机理:在低于pH2的时候硅氧键催化水

解;在pH大于7或8的时候,被水中-OH溶解。pH小于2的时候,-Si-O-Si-可以

被H3O+进攻,固定相就会流失断裂。随着时间的推移,随着载碳量下降保留

值会慢慢下降。这种情况在由三甲基硅烷等短链封端的色谱柱时,应当尤为

注意。长链C18固定相因为空间位柱效应,对于这样一种流失有一定的保护作

用,但是最终仍然是慢慢被侵蚀,尤其是温度高于环境时。空间保护、密度

图层键合固定相有助于防止硅胶键合相的流失。聚合物固定相在这种条件下

表现良好,但是比起硅胶固定相的柱效要低。
  在高pH方面,一定需要有保护硅胶基体免于羟基进攻的措施。一旦溶解

过程开始,随着固定相被掏空,色谱柱会最终失效。所以开发了双硅烷交联

C18(bidentate C18),杂交等耐高pH的特种色谱柱。这些柱子都使用了化

学方法来保护固定相避免羟基的洗脱。上述的特种柱子能够承受pH11-12的条

件。在此碱性,pH条件下,柱子要避免高温使用。当然,聚合物色谱柱能够

在pH13甚至14的条件下使用,但是,前文已经指出,聚合物柱比硅胶柱效果

要差些。
因此,在这个论点上,硅胶柱能够在pH2-7以外的范围使用,但是普通硅胶色

谱柱要格外小心,由其是在高温条件下。
 博主注:再一次提醒自己,pH的使用是液相色谱的精髓之一。

怎么调节,物质在等pKa的pH条件下出峰时间中等,碱性在高于pKa,酸性低

于pKa时保留时间延长,峰形也漂亮,反之出峰快,峰形不好说。除了这个,

估计什么都要靠运气了。

误区九:当代HPLC柱至少应该承受1000次进样

  否。现代HPLC色谱柱能够承受的进样数量由许多因素决定。有些因素基

于以下模式:反相色谱,离子交换色谱,排阻色谱,正相色谱,手性色谱,

亲水交互色谱等等。有些因素基于不同的填料基体:硅胶基质,杂交基质,

氧化皓基质,聚合物基质等填料,或者是基于不同的硅胶软硬程度和涂层的

交联程度。有些因素基于固定相本身:空隙率,键合方式,聚合,单层键合

,或者包埋方式。其他的因素就和条件有关了:pH,温度,流动相组分,缓

冲组成,流动速率,压力等等。还有些和样品有关:完全标样,洁净样品,

样品pH,样品体积(含量),样品杂质,分析物分子本身特性等。
  如果一根柱子被滥用,比如在pH范围外,或者流速范围外,很有可能连

50次进样都成问题。如果每次样品都没有什么杂质,5000次使用也不为过。

如果色谱柱不总是在其承受力上限使用,寿命会更长。如果柱子进入多种多

样的样品,但是从来不冲洗柱子里的残留,寿命必然减少。
  笔者(原作者 译者注)对于许多制药公司的经验表明,绝大多数5μm反

向色谱柱在分析物质结构,简单药品混合物,和标样的情况下能够承受至少

1000次测试。如果样品“很脏”,比如没有严格完全的净化生物样品提取物

,环境样品提取物,1000次进样是有待考验的。
  所以说柱子能够承受的次数不是绝对的,而是取决于柱子的类型(本身

体质和适用范围 译者注),操作条件,样品洁净程度和滥用程度。即使有些

仪器能够记录柱子的使用,实际上只有不到15%的研究人员记录了色谱柱能够

用的次数,很多研究人员都不知道到底能够用多少次
  博主注:用仪器的都知道要保养,奈何就是有人把过粘,过脏

的东西一针一针的往里打,这样的惨剧博主不是第一次见了:纯的油质,黄

黑色的,20μL,卡嚓一针进了六通阀;50uL当5uL的针装在自动进样器上,

不设延迟时间,直接卡嚓往GCMS里面搞,还要不要仪器了,要不要人活。所

以说,样品要接近,溶剂要过膜超声。

误区十:色谱柱总是应该紧紧的密封,以防被填料被空气破坏

  否。通常色谱柱两头的小孔不到0.5mm,所以如此小的区域,空气进入色

谱和流动相蒸发很小。即使是一个小气泡进入色谱柱,也不能够有足够时间

来进入填料床,接触足够的固定相而造成损害。假若柱子中有了这么个小的

气泡,只要装在色谱设备上运行一次,在高压下会立即溶解,然后流出色谱

柱,不会有任何危害。当然,如果你为了保险,死死的拧紧也行。柱子也都

配备了螺纹柱塞(原文是 male compression fitting caps, 英文的这个传

神,翻译不出来那个感觉,罢了 译者注),手动就能够拧紧,以防止溶剂蒸

发,空气进入填料。
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现在有很多色谱柱好像可以反冲啦,只是不到万不得已不要使用
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dahua1981
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原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
这要看柱子说明了
有的支持反冲有的则不行
大多数还是建议不要 对柱子影响比较大
dahua1981
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很有用的知识,不过为什么复制粘贴的时候不编辑一下啊??
童话仙子
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原文由 yu3226033(yu3226033) 发表:
HPLC色谱柱可以反冲.

有的厂家的可以反冲吧,这个也不一定了的
童话仙子
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原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
这要看柱子说明了
有的支持反冲有的则不行

是不是要看说明书来操作呢,估计支持反冲的柱子也不是很多了的
童话仙子
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原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
这要看柱子说明了
有的支持反冲有的则不行
大多数还是建议不要 对柱子影响比较大

嘻嘻,师兄也在这里啊,迪马积分看上去也很高了呢,俺也来学习学习啊,估计色谱柱建议反冲的不是很多吧?
童话仙子
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原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
极限的柱子一般都建议反冲的

他们的色谱柱都反冲???
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