1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

二、实验原理

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。目前关于凝胶层析的原理有许多假设和理论，普遍接受的是分子筛效应。凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。对凝胶层析分离的简单过程可用图1表示。

图1 小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，

大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过

本实验是分子筛凝胶过滤法的初步训练，采用葡聚糖凝胶G-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子红葡聚糖和小分子维生素B₁₂。

三、试剂和器材

试剂

蓝葡聚糖- B₁₂混合液、葡聚糖凝胶Sephadex G-25

器材

层析柱：柱管（1厘米×20厘米），附有一小段乳胶管及螺旋夹

洗脱瓶（下口锥形瓶，250mL）

试管及试管架

量筒（10mL）

T6新世纪紫外可见分光光度计

四、操作

（一）凝胶的预处理

为使样品通过凝胶时具有良好的流速并能很好的分离，应对凝

胶进行预处理。

（1）凝胶必须于使用前在过量的溶剂中充分地膨胀。

（2）用倾泻法除去混杂的细小颗粒，重复3-4次。

在膨胀时间内，应避免剧烈搅拌，以防止破坏交链结构。

（二）柱的选择

为了防止分离受管壁效应影响，一般应选用内径大于2.5厘米的柱。为了便于组织拆卸，下口可取一个适当削磨过的橡皮塞倒插入管底，这种装法亦可避免层析柱的死区而有利分离。橡皮塞上还覆盖一层尼龙绸或脱脂棉，以防止葡聚糖颗粒流出。

（三）装柱

装柱是凝胶层析中最重要的一步操作，实验时必须将凝胶床装得十分均匀。首先，将柱垂直地安装好。层析柱下端及尼龙绸必须充以溶剂，不能留有气泡，然后，将已膨胀的凝胶沿着玻璃棒小心地徐徐灌到柱中，尽量一次装完，以免出现不均匀的凝胶带，为此在装柱时需打开下口，并调节适应的流速。灌注时，凝胶悬浆切不可太稀或太粘。若太稀，分几次装出的凝胶床往往不是均匀的，过于粘稠，会吸留气泡。

（四）加样

打开柱的下口，让溶剂（水）逐渐流出，（或由上面吸走，亦可），待到床面上只留下极薄的一层溶剂时，关闭出口管上的螺旋夹。

拧开柱的上阀，用胶头滴管吸取混合液，小心地将3~5滴此样品垂直加到凝胶床的表面上。注意加样时勿将床面凝胶冲起，亦不要沿柱壁滴加样品，因为这样样品易从柱壁与凝胶床之间漏下。

然后，打开出口管，待样品全部进入床后，关闭柱的下口，加入3cm水后，再打开柱的下罚，加水进行扩展洗脱。

在全部操作期间，要避免柱床流干。

（五）洗脱

加蒸馏水洗脱，用小量筒收集洗脱液，用螺旋零部件调节洗脱速度为0.5mL/分，每次1mL，依次倒入已预先编好号码的试管中，观察并记录洗脱中的现象。

收集15管左右，先收集的一部分溶液呈蓝色，后收集的一部分溶液呈红色。

每管加入蒸馏水1mL，稀释1倍，倒入比色皿中，于分光光度计测定光密度，蓝色溶液部分在680nm波长下测定，红色溶液部分在520nm波长下测定。以mL数（或管数）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘出洗脱曲线。

五、实验结果

溶液的吸光值为：

表1 680nm下吸光度

ml数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
吸光值	0.005	0.007	0.009	0.013	0.015	0.064	0.097	0.113	0.065	0.021	0.014	0.011	0.007	0.006	0.004

表2 520nm下吸光度

ml数	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26
吸光值	0.045	0.051	0.098	0.132	0.161	0.175	0.163	0.160	0.153	0.134	0.120	0.094	0.078	0.066	0.054	0.050	0.043	0.039

洗脱曲线如下：

六、思考题

1．利用凝胶层析法分离混合样品时，怎样才能得到较好的分离效果？

答：1）柱子要细，要长，越细越长越好，流速会变慢，时间会延长，因需要而异2）缓冲液一定要选好，常用的有磷酸，Tris-Hcl，Tris-甘氨酸，醋酸等。凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。3）控制凝胶的流速，凝胶层析，流速一般不是很快，一般0.5～1ml/min，但也不能太慢，因为太慢有扩散现象，峰会很宽。应保证凝胶能充分的沉淀且分布的较均匀。4）装柱时注意柱压，柱压过大时填料会塌陷。5）样品的浓度和加样量的多少是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%～2%，制备用量一般为柱床体积的20%～30%。

2．比较凝胶层析与纸层析在实验原理上的区别。

答：

纸层析法是根据混合物在水和有机溶剂两相中的分配系数不同，不同的物质随流动相移动的速率就不同，于是将混合物分离开来，形成距原点距离不相等的层析点。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析。

凝胶层析的原理是分子筛效应，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱;反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子,它们也能在凝胶颗粒内外分布,部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。因此，适用的范围要广泛一些。