主题：【转帖】HPLC法测定抗生素含量和有关物质的表述方式

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发表于：2012/04/16 19:11:02 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

应符合中国药典2000年版附录V D高效液相色谱法及附录XIX A药品质量标准分析方法验证的有关规定。若另有规定者应于正文中写清楚，如拖尾因子，附录中规定应在0.95~1.05，某品种若不能达到，可另制订合适指标。

一. “含量测定”可按下述格式表述

多数抗生素类药品的含量测定采用的是HPLC-紫外检测器法，其书写格式包括以下内容：

（一）照高效液相色谱法（附录V D）测定。

（二）色谱条件与系统适用性试验：包括以下内容：色谱柱填料种类，流动相组成及配制方法，流速，检测波长，柱理论板数，拖尾因子，分离度测定溶液配制方法及分离度要求，进样量，数次进样对照品溶液应达到的精密度等。

注：1. 如果理论板数对分离度及定量测定结果影响不显著时可省略。

2 如果色谱峰的对称性较好，可不规定拖尾因子，但对称性差的品种应规定拖尾因子。

3. 考核分离度的方法有：

（1）用已知杂质对照品，测定其与主组分峰的分离度，如头孢克洛含量测定时规定头孢克洛与d-3异构体对照品混合溶液的分离度应符合规定。

（2）杂质对照不能获得的情况下，可通过样品的适当处理使降解，测定降解物与主组分峰的分离度，如头孢呋辛钠含量测定中，取对照品溶液在60℃水浴中加热10分钟，冷却，使部分头孢呋辛转变为去氨基甲酰头孢呋辛后，测定头孢呋辛峰与去氨基甲酰头孢呋辛峰的分离度。

（三）对照品溶液的制备：应写清楚对照品溶液制备所用溶剂及溶液浓度。若储备液与测定液溶剂（稀释液）有差异时，应分别写清楚配制方法。

（四）测定法：应写清供试品溶液的配制方法。对于制剂若由于辅料会影响取样均一性者，还应规定合适的取样量。对于溶液稳定性差的品种，应写清“临用前配制”或“供试液应冷处保存”等。含量测定溶液浓度的确定，除了应在线性范围内外，应以规定的进样量测定的峰面积积分值在6位数以上为宜。

另外，也有一些无特征紫外吸收物质，例氨基糖苷类抗生素，可以采用HPLC-蒸发光散射检测器（Evaporative Light-Scattering Detector, ELSD）法测定含量。当采用该法测定含量时，书写格式可参考上述HPLC-紫外检测器法，但应注意以下几点：

（1）“色谱条件与系统适用性试验”项：液相色谱条件中应注明流速，因为流速大小直接影响ELSD的检测器条件；检测器条件中应注明漂移管温度，载气流速。系统适用性试验一般要包括数次进样对照品溶液应达到的精密度（RSD），以确保检测器的稳定性（一般来说，该法要求RSD不得过2%）。

（2）“对照品溶液的制备”项：由于ELSD的响应值（A）与进样浓度（C）间呈指数关系（A=aCb，a，b均为常数），在采用该法测定含量时，计算方法宜采用随行校正曲线法（lgA=algC+b，a，b分别为校正曲线的斜率、截距），故对照品溶液的浓度至少应包括高、中、低3个不同浓度，浓度设计以能覆盖供试品溶液浓度为宜。

（3）“供试品溶液的制备与测定”项：同HPLC-紫外检测器法，但计算方法采用的是随行校正曲线法，即供试品浓度是根据供试品溶液中主峰峰面积和随行校正曲线（lgA=algC+b）来确定的，具体计算方法可参见“3 [检查]项撰写细则”一章中的“1.7 组分检查或纯度检查”部分。

二. 有关物质测定*

（一）有关物质测定的色谱条件与含量测定相同者，可参照中国药典2000版中头孢呋辛钠有关物质检查法表述。但其中有如下几点不完美：

1. 供试品溶液浓度低于含量测定时供试品浓度，有可能影响杂质的检测，应适当提高。

2. 结果评价应以加校正因子或不加校正因子的主组分自身对照法计算出单个最大杂质或表观含量大于0.1%含量以上的杂质总和的含量或表观含量，而不以单个最大杂质或杂质峰面积总和不得大于对照品溶液主峰峰面积的多少倍表示。

（二）有关物质测定的色谱条件与含量测定不同者，可参照中国药典2000年版中头孢克洛有关物质检查法表述，但其中有如下表述方法需作修改。

1. 流动相梯度洗脱方式以列表方式表述如下：

流动相A与流动相B按下表变换方式进行洗脱：

时间（分）

流动相A（%，V/V）

流动相B（%，V/V）

0~30

95%®75%

5%®25%

30~45

75%®0%

25%®100%

45~55

0

100%

55~56

0®95%

100%®5%

56~71

95%

5%

2. 结果评价方式同上，应计算出单个最大杂质含量或表观含量大于0.1%以上的杂质总和的含量或表观含量。

（三）有关物质测定中明确规定对照品溶液数次进样后相对标准偏差的限度，并以数次进样的平均值计算出各有关物质的量。

（*注：最低检出限或最低定量限的确定应按照中国药典的要求进行验证，以保证结果的可*性。）

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