1 实验部分
1.1 材料
防腐剂: 壳聚糖(分子质量1.26 ×106 , 脱乙酰度为91 %) , 购自青岛百成海洋生物资源开发公司;壳寡糖(分子质量3 000) 、Germallplus、茶树油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯等, 均由北京化工大学化大化新科技股份有限公司提供。
菌株: 大肠杆菌(代表革兰氏阴性菌) 、金黄色葡萄球菌(代表革兰氏阳性菌) 、黑曲霉(代表霉菌) 、白色念珠菌(代表酵母菌) , 均由北京化工大学微生物实验室张淑荣老师提供。
培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌) : 牛肉膏0.3 g , 蛋白胨1 g , NaCl 0.5 g , 琼脂1.5 g ~2.0 g , 蒸馏水100 mL , pH 7.0 ~7.2 ; 察氏培养基( 培养霉菌) : NaNO3 0.2 g , K2HPO4 0.1 g , KCl0.05 g , MgSO4 0.05 g , FeSO4 0.001 g , 蔗糖3 g , 琼脂1.5 g~2.0 g , 蒸馏水100 mL , pH 自然; 沙堡氏琼脂培养基(培养酵母菌) : 蛋白胨1 g , 葡萄糖4 g , 琼脂1.8 g , 蒸馏水100 mL , pH 5.6。
1.2 方法
1.2.1 菌体的斜面培养和菌悬液的制备
细菌于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化(37 ℃下培养24 h) ; 酵母菌于沙堡氏斜面培养基上活化(28 ℃下培养24 h) ; 霉菌于察氏斜面培养基上活化(28 ℃培养7 d) 。活化后的菌种用生理盐水稀释成一定浓度的菌悬液。
1.2.2 最小抑制浓度(MIC) 的测定
方法见文献。按稀释分离平板菌落计数法进行计数, 并计算抑菌率:
抑菌率= (对照实验菌落数- 相应试样浓度的菌落数)/对照实验菌落数×100 %
可以根据抑菌率为100 %时的防腐剂的浓度, 推出防腐剂的最低抑菌浓度(MIC) 。
1.2.3 抑菌活性试验方法
添加一定量(5 mL) 的至其最低抑菌浓度的防腐剂溶液到90 mL培养基/ 250 mL (体积) 摇瓶中, 并加入5 mL 菌悬液,将摇瓶置于恒温摇床(细菌: 36 ℃±1 ℃, 真菌: 28 ℃±1 ℃) 中以180 r/ min 振荡, 每隔一定时间取样5 mL , 与不加防腐剂及加入HAc 溶液的菌液作对照。以去离子水为空白样作参比, 用紫外分光光度计于650 nm 波长下测定培养液的浊度( OD) , 并以此表征防腐剂的抗菌活性。