主题：【讨论】提问帖（5.17）色谱柱填料的孔径，对样品的分析分离有什么影响（答案已出）

粒径减小，柱效提高，相对可以说分离变好，
但是粒径小会引起高的柱压，因而会用比较小的流速，从而造成
分离时间的延长和一定程度的峰展宽，
这个是个矛盾的问题，只要找到最佳契合点即可了

原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
粒径减小，柱效提高，相对可以说分离变好，
但是粒径小会引起高的柱压，因而会用比较小的流速，从而造成
分离时间的延长和一定程度的峰展宽，
这个是个矛盾的问题，只要找到最佳契合点即可了

老师搞错了，问题是关于孔径的

请问版主是色谱柱的孔径还是填料的粒径的影响啊

基质要成为填料，首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有：薄壳型、无定形全多孔、球形全多孔，另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀，但涡流扩散大，渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小，渗透性好；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话，具有传质阻抗小、载样量大的优点，柱效也更高。球形填料外形对称，比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量，因为填料粒度有一定分布范围，一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱压的关系为：柱效与填料大小成反比，柱压与填料大小的二次方成正比。所以，快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米长，就是为了降低柱压；需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。
　　基质做成合适的形状和大小后，可以通过各种化学修饰（modified）的手段，获得各种不同选择性的填料。有时候，我们增加柱长、降低填料粒度都无法把一个化合物分离的更好，这时候就要考虑使用选择性更好的填料。

较窄的孔径，可以增加柱效，它会影响范氏方程中的涡流扩散，但是同时它会增大柱压、减少载样量，一般的内径是2.1毫米到4.6毫米。

对小分子来说，孔径大的填料柱效肯定会相对低些了，保留时间也会短。
但做生物大分子，必须用大孔径填料，否则大分子物质不能进入填料的孔径中，达不到有效分离

填料孔径越小，允许的流动相线速度越高。最佳流动相线速度取决于固定相的颗粒大小。在最佳线速度时，色谱柱生成的理论塔板数最高。对于内径为 4.6mm 的色谱柱，10um 的颗粒流动相线速度为 0.75ml/min 或 5um 的颗粒流动相线速度为 1.5ml/min 时，塔板数最高。

孔径

测量法和表示

    孔径分布和比表面积可以通过相同的方法来测量，如：氮吸附法和汞空隙率测定计平均孔径也能通过逆向分子排阻法来测量，但真正的孔径分布不能用个方法来测量。不过，因其它方法存在一些问题，高聚物填料仍然要采用逆向分子排阻法。孔径用nm或埃做单位。孔径分布的值是标称的，而且不同生产商有不同的方法。所以，某生产商标称10nm的可能与另一生产商标称8nm或12nm的相同。

孔径与保留

    如上节指出的，孔径是填料物理性质的一个基本因子，并决定颗粒相比率（phase ratio）。进一步决定了填料的保留性质和载样量。

孔径和分子量
  被分析物分子小随分子量增加而增大。如果其分子量大小约为孔径的三分之一或大，则传质会严重受阻并造成低效能和峰展宽。这样的情况下，要用更大孔径的填料。对所有标准分析问题，通常用孔径在大概6nm到13nm之间的填料。更大孔径的填料也可以用在肽类分离上。分子量比肽更大的，如蛋白质，用30nm孔径的填料更加合适。但这样的填料与小分子作用的不好，因为比表面积减少了。对被分析物分子量小于3000的，应用孔径小些的。被分析物分子量大于10000的，应用孔径30nm的填料。分子量介于3000到10000的，大的小的都可以得到满意结果。

孔径分布
    大HPLC填料的孔径分布跨度有一个数量级。这样的分布对大多数实用目的已经足够的窄了。然而，微孔的减少时填料的性能提高了。这可能是有窄孔径分布的填料如Waters Spherisorb的一个优势。（译者：不是我给她卖广告，原文是来自Waters的资料，我跟Waters没有任何关系。）

非孔填料
    非孔填料能用于高分子量的、在大孔径填料中表现出扩散受限制的被分析物。但是，只能得到有限的比表面积。

选择正确的孔径
被分析物的分子量            推荐使用的填料孔径
<3000                          6到13nm
3000到10000                    10nm
>10000（例如蛋白质）          30到100nm
非常大的分子                  非孔填料

比孔体积
    和比表面积以及孔径分布的测量方法相同的技术也用于产生填料比孔体积的测量结果。但也能用其它方法来测量，如分子排阻色谱法和滴定法。它的单位用ml/g。

比孔体积与颗粒强度
    比孔体积是颗粒空隙的量度。比孔体积越大，颗粒中实际物质的比例越小。所以，有大比孔体积的颗粒比比孔体积小的强度小。硅胶填料的比孔体积为0.5ml/g或更小，如Waters Spherisorb或Nava-Pak，机械性方面极耐用。许多的HPLC级硅胶填料的比孔体积为1ml/g，通常这对多数应用已经足够了。

选择结实的填料
比孔体积                强度/结实度
1.0ml/g                      ++
0.5ml/g                    ++++
++++ 优秀  ++一般

比孔体积与分子排阻色谱
    在分子排阻色谱，颗粒空隙率是决定填料使用的关键参数。颗粒空隙率增加，比孔体积也增加。如果硅胶基质的填料用于分子排阻色谱，填料的比孔体积最好有1ml/g。

选择
产品              比表面积      比孔体积        孔径
                [平方米每克]  [毫升每克]        [埃]

μBondapak          330          1.00          125
Delta-Pak          300          1.00          100
Delta-Pak 300      125          1.00          300
Nava-Pak            120          0.30            60
Resolve            200          0.50            90
Symmetry            335          0.90          100
Waters Spherisorb  200          0.50            80

比较
                      孔径        比孔体积
保留性                  小          -
载样量                  小          -
强度                    小          小
传质                    大          -
分子排阻                -            大
高分子被分析物          大          -
    为了保留性、载样量和强度，应选择小孔径的填料。在孔中测到的传质较低。对大分子量的被分析物，应选择孔径大的填料。用在分子排阻色谱，填料应有大的比孔体积。

，选择什么样填料孔径的柱子是根据分子量的大小来确定的。我们先了解一下填料孔径对分离度有什么样的影响，120A的色谱柱通常适用的范围为分子量<10000的，如果分子量太大，在填料为120A孔径的柱子上分离度会比较差，因为样品分子在色谱柱上有较好的是由于可以进入到填料的微孔里面，与键合在表面上的C18长链相互作用，通常孔径直径需要大于分子直径的3倍以上才不会对分析造成影响。
因此一般分子量10000一下的化合物建议用120A的柱子来分析，分子量大于1W小于20W的用300A的来分析，分子量大于20W的就要用凝胶柱了。

中药成份的化合物通常分子量不会太大，120A孔径的柱子应该足够了。我们选柱子的时候很少问孔径，因为分析大分子的机会并不是很多，这个时候60A、80A、100A、120A对分离都不会有太大的影响，倒是色谱柱封尾不封尾、载碳量大不大这些考虑得更多一些，因此没有特殊说明通常我们都会默认为是、80A、100A、120A这种。现在做多肽的越来越多，考虑到多肽通常分子量比较大的原因，他们选柱子的时候通常首先就考虑孔径的问题。