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主题：【分享】高效液相色谱法的建立步骤介绍

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发表于：2012/06/08 19:21:35 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效液相色谱法HPLC是近年来发展最快的一门新的分析分离技术，正越来越多地用于质量检验、实验研究和制备分离，已成为化学和生物化学不可缺少的高效、快速、灵敏的分析分离手段。

步骤一：
　　我们应了解样品成分和性质。包括：
１．所含化合物的数目

２．化合物的化学结构（官能团）

３．化合物的分子量

４．化合物的pKa值

５．化合物的UV光谱图

６．样品基质的性质：溶剂，填充物等

７．化合物在有关样品中的浓度范围

８．样品的溶解度

９．是否是手性化合物

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2012/6/8 19:22:24 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

步骤二：
　　　样品的预处理：

１．可直接进样的溶液

２．需稀释、缓冲pH或添加另一液体

３．能在流动相中溶解的固体

４．含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前将其去除的溶液

５．含有不溶性赋形剂的混合物

主要HPLC方法的特性

反相HPLC:
流动相：水/有机溶剂
色谱柱：C-18(ODS),C-8,苯基，三甲基硅烷(TMS),氰基

应用范围：首选为能溶于水/有机混合液的中性或非离子化合物

正相HPLC：

流动相：有机溶剂混合液
色谱相：氰基，二醇基，氨基，硅胶
应用范围：当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好的选择；首选为不溶于水/有机溶剂混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC（硅胶最好）

离子对HPLC:
液动相：水/有机溶剂
　　　　一种缓冲物控制pH，和离子对试剂
色谱柱：C-18,C-8,氰基
应用范围：为离子或可电离化合物，尤其碱性或阳离子化合物的良好选择。

建立HPLC方法的目的：
１．分离度：精密度和抗干扰的定量分析需Rs>1.5

２．分离时间：<5-10min时日常工作较理想

３．定量：含量测定；<=２％（１SD）；要求不高的或痕量分析：５％

４．压力：最好<150bar;<200bar通常是基本的（假设为新柱）

５．峰高：最好为信噪比在的窄峰

６．溶剂消耗：每个样尽量少消耗流动相

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2012/6/8 19:23:25 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

保证良好柱寿命的步骤：

１．用填充良好的柱

２．尽量减小压力波动；避免机械及热冲击

３．用保护柱和在线滤片

４．经常用强溶剂冲洗柱子

５．预处理“脏样品”，以尽量减少无用的强滞留成份和微粒

６．用稳定的固定相

７．用低于60度的柱温

８．硅胶基质柱要保持流动相pH在3-7之间；如超出此限制操作是，须安装预柱

９．在水溶液流动相或缓冲液中加100ppm的叠氮化钠

１０．过夜和贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，以纯乙腈保存柱，避免高浓度的水和醇类。

色谱常用符号与术语：

ACN:乙腈
RRT:相对保留时间
F:响应因子
MTBE:甲基叔丁醚
pKa：溶质酸性常数的负对数；当pH=pKa时，溶质中有一半是电离的
ODS:十八烷基硅烷Octadecylsilyl
BDS:碱纯化硅胶 Base deactive silica
TEA:三乙胺
TBA:四丁基铵离子
THF:四氢呋喃
TLC:薄层色谱法Thin layer chromatography
TMS:三甲基硅烷

以上为《实用高效液相色谱法的建立》摘抄部分。

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