2 组织或器官特异性启动子
这类启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中,目前已发现这类启动子中一般同时存在几种 控制组织特异性表达的元件,其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。深入研究这些启动子不仅有助于阐明植物形态、 发育、代谢途径等基础理论,而且具有广泛的应用价值。
2.1 根特异启动子
根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题,研究根中特异表达基因及其启动子无疑是重要的。拟南芥根中特异表达的黑芥子酶(myrosinase)是由Pyk10基因编码的。Pyk10启动子中存在若干器官特异性表达和 植物激素应答的特异元件,如ACGT-核心序列、CANNTG-motifs、GATA-motifs、诱导物(elicitor)应答元件W-box((T)TGAC(C))、植物激素应答 元件(如as-1元件、生长素和脱落酸应答元件、Myb元件)和细胞特异表达元件等。其中ACGT,CANNTG,GATA等顺式作用元件是决定组织器官特异 表达的转录因子结合位点,Myb元件在控制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信号传导通路中起作用。
根特异表达系统可用于研究转基因植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等问题。BoriSjuk等用根特异启动 子mas2',GFP和烟草钙网蛋白(calreticulin)基因构建融合表达载体,水培转基因烟草结果表明,根细胞不仅能够高效生产GFP,而且可将目的 蛋白质分泌到液体培养基中。因此利用该启动子与其他有用的能编码蛋白质的基因融合,不仅可大量生产目的蛋白质,且更便于回收产物。
2.2 茎特异启动子
Trindade等利用cDNA-AFLP技术从马铃薯中分离了一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511(transcript derived fragment),其基因Stgan可能参与植物体内影响赤霉素水平的复合物的合成。在NCBI数据库中,比较Stgan启动子与马铃薯的patatin Ⅰ和Ⅱ、 蛋白酶抑制子、nodulin 22K和23K等编码蛋白质基因的启动子,发现它们包含一些可能与蔗糖应答反应有关的共有序列;该启动子还包含植物 中几个保守的转录因子(如Dof1,Dof2,Dof3和PBF)的结合位点。构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草,GUS组织化学染色显示该启动子 驱动基因在茎结节处特异表达,可能参与块茎形成过程。
研究在茎中特异表达基因的启动子,不仅可从分子水平了解茎的发生、分化过程,更重要的是利用这些启动子调 节植物代谢可满足人类需求,如人们对木质素生物合成及其调控的研究。木质素是植物体内仅次于纤维素的一种含量丰富而重要的有机大分子 物质,它的存在对于增加植物机械强度、远距离水分运输和抵抗外界不良环境的侵袭都是非常有益的。然而,木质素的存在也有一定的负面作 用。因此,人们希望通过调节木质素的合成以降低其含量。目前多使用CaMV35S启动子驱动目的基因,近年来已分离一些木质素生物合成途径中 关键酶基因的启动子,如4CL,F5H等基因的启动子,人们正在尝试利用这些特异性启动子来调节木质素的生物合成。Bell-Lelong等已从拟南芥 中分离了肉桂酸羟-4-基化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因的启动子,本实验室首次从毛白杨中分离了C4H启动子,并对该启动子的功 能进行了初步鉴定。GUS组织化学染色和GUS荧光测定结果表明。G4H启动子驱动外源基因在烟草茎的维管组织中丰富表达,有望将来利用该启动 子驱动功能基因调控木质素的生物合成过程。
2.3 叶特异启动子
Marraccini等从咖啡(coffea arabica)中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)小亚基基因RBCS1, 该基因在一年生植物咖啡的叶中特异表达。研究发现RBCS1启动子上游GTGGTTAAT序列与豌豆RBCS3A启动子的BoxⅡ核心序列相同;在其启动子G -box(GCCACGTGGC)两侧分别有一个类I-box(核心序列为GATAAG),形成I-G-I结构,推测G-box十个碱基的回文结构可能结合某个转录因子;其AT-1 box(AGAATTTTTATT) 与其他RBCS和CAB基因的AT-1 box(AATATTTTTATT)相比只有两个碱基不同;类L-box(AAAATTAACCAA)与马铃薯RBCS1和RBCS3A启动子的相同。由此 可见,植物叶特异表达顺式元件具高度保守性。
有趣的是Taniguchi等在玉米中发现了一个双元启动子系统(dual promoter system)。PPDK(pyruvate, orthophosphate dikinase)是C4植物光合反应中的一个叶绿体酶,该酶基因Pdk具有一个双元启动子系统(C4Pdk启动子和细胞质Pdk启动子)。这 两个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异,C4Pdk启动子驱动Pdk转录成较长的mRNA。基因产物定位在叶绿体中;细胞质Pdk启动子在 Pdk基因的第一个内含子中,驱动Pdk转录成较短的mRNA,它所编码的蛋白质定位于细胞质中,又称为细胞质Pdk启动子。C4Pdk启动子是受光诱 导的强启动子,驱动基因在玉米叶肉细胞中特异表达;而细胞质Pdk启动子是个弱启动子,且不具有组织特异性。大多数C4植物的光合作用相关 基因的表达具有细胞特异性,且主要在转录水平调节基因表达活性,因此,可利用该启动子在C4植物叶肉细胞中高效表达外源基因。
2.4 花特异启动子
高等植物发育过程中花器官的形成是一个十分复杂的过程,它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化 ,同时伴随大量基因的协同表达。目前人们最为关注的是花药中特异表达的基因,抑制或破坏这些基因的表达可导致雄性不育,即可利用基因 工程的方法创造雄性不育系。
人们克隆了许多花药特异表达的基因,如在花药绒毡层特异表达的TA29,A9、在花粉壁特异表达的Bp4A等,但这 些基因都是在花药营养细胞中表达,与生殖细胞的分化无关。Singh等从百合(Lilium longiflorum)中克隆了一个LGC1基因的启动子,该启动子 驱动的基因只在雄配子细胞中表达。LGC1启动子-242~-183 bp之间可能包含某种顺式作用元件,它的缺失会导致细胞特异性表达特性丧失,由 此可知LGC1在生殖细胞中的表达特异性可能是由于其他细胞中存在某些转录因子抑制该基因表达的结果。这是迄今为止发现的第一个有关雄配 子细胞特异性的启动子,在研究花药发生和受精作用中将会是一个有用的工具。
2.5 果实、种子特异性启动子
利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达,不仅可提高基因在这些部位的表达量,将生物能耗降到最低 ,利于表达产物的分离,而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质。
番茄E8启动子是成熟果实中乙烯应答性基因的启动子,其-409~-263bp可控制E8基因在果实成熟过程中特异表达 ,-2181~-1088bp为乙烯应答激活域。Sandhu等利用E8启动子驱动呼吸道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株,用果实特异表达抗原喂饲小鼠,可诱导小鼠产生特异 的粘膜免疫反应、血清学抗体反应及TH1型细胞免疫反应。基因表达调控与免疫学的有效结合,使得转基因植物口服疫苗可在不久的将来问世。 2A12是番茄中另一种果实特异性启动子,毛自朝等利用该启动子驱动ipt调节果实内源激素的含量,不仅可获得无籽果实,还能改善果实的品质 。
种子特异性启动子中研究较多的是胚乳特异性谷蛋白基因启动子。谷蛋白占水稻种子储藏蛋白总量的70%~80% ,早在1986年Takaiwa等就克隆了第一个水稻谷蛋白基因的cDNA。该基因转录起始位点-261~-1 bp之间有若干控制种子特异性表达的顺式作用元件,如AACA-box、种子凝集 素-box、未成熟种子核因子结合位点等。此外,启动子更上游处还有若干增强子和调节元件,如-300bp处的RY重复序列,它是核蛋白的结合位 点。Yoshihara等研究发现水稻谷蛋白启动子上游-104~-60bp之间有两个顺式作用元件AACA和GCN4,GCN4能增强启动子的活性,而启动子的组织特异性则须两者协同作用。
虽然植物食物中包含人类营养所需的绝大多数矿物质和有机养分,但日常摄入的食物往往不足以提供人体所需的 营养。因此人们希望通过植物基因工程提高植物中所含的营养物质。水稻谷粒中含有铁蛋白,但多积累在糊粉层,在谷粒加工过程中会失去很 多铁。Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因,使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加,而且铁蛋白主 要积累在胚乳中,不会在食品加工过程中丢失。无独有偶,Datta等利用水稻谷蛋白特异启动子驱动八氢番茄红素合酶基因PSY,在水稻胚乳中 成功合成维他命原A。
以植物为生物反应器生产生物可降解塑料是本实验室研究目标之一。叶梁等使用大豆7S种子特异性启动子,构建 二价和三价种子特异性表达载体转化油菜。这样将产物聚-3-羟基丁酸酯(PHB)定位与种子质体中,不仅增加了底物供应,也减少PHB对植物生长 发育的影响。为优化已有表达框架,减小基因沉默发生几率,Zhang等从油菜H165基因组DNA中分离到napinB启动子的部分序列——nap300。序 列分析表明,napinB启动子包含一些在进化上保守性很高的序列,如AT-rich sequenc,TACACAT保守序列、RY重复序列、G-box等,这些顺式作 用元件可能对种子特异性表达起重要的调控作用。将nap300与GUS基因融合转化烟草,GUS在胚和胚乳中均有表达;GUS荧光检测显示nap300启动 子具有驱动基因在种子发育晚期表达的能力。