基因定点突变，顾名思义，就是把目的基因上的一个碱基有目的的替换为另一个碱基。体外定点突变时目前分子生物学领域中一种快速有效地手段。产生定点突变操作及所需仪器简单，随着技术的发展，方法也越来越快捷简便。定点突变除了可以生成点突变，多点突变外，还可以人为产生碱基删除和添加等。体外基因定点突变是实验室中优化改造基因，研究基因功能的常用方法之一。通过改造基因序列，可以对相应氨基酸序列进行改变，进而影响蛋白质的结构和功能，探讨突变氨基酸位点在蛋白结构和功能中所起的作用。

在我多年的实验中，体外基因定点突变是其中一项重要的内容。在这里，我与大家分享一下我的实验方法和心得体会。多年来，我所采用的基因定点突变的方法主要有三种，这可能也包括了目前所有的定点突变的方法。基因定点突变使用的主要仪器就是PCR扩增仪(biometra)，而这是每一个分子生物学实验室的必需品，也就是大家吃饭的家伙。下面从繁到简对我所采用的突变方法进行一下简单描述。

我所使用过的定点突变方法简单的说就是三步，两步和一步PCR法。

三步PCR法是我早期在实验室使用的定点突变方法。

利用三步PCR法构建一个点突变，需要4条PCR引物：L1，L2，R1和R2。L1和R1是目的基因5‘和3‘端的引物，分别包含起始和终止密码子。突变点设计在引物L2和R2的正中间位置，L2和R2是完全互补的两条PCR引物，长度一般在28-40 bp之间，推荐长度31-35 bp，这样可以保证突变的两边有效搭在一起。

三轮PCR均采用常规PCR反应条件，第一轮分别以L1和R2，L2和R1扩增获得目的片段L和R。第二轮PCR，不需要引物，仅加入模板L和R各100 nmol，进行约20 轮的PCR反应，获得产物m1。第三轮PCR以m1为模板，L1和R1为引物进行PCR扩增。最终得到目的产物m。得到的PCR产物进行克隆转化得到进一步扩增，便获得了突变的目的基因。

在随后的实验中，我将三步PCR法简化为两步法PCR。两步法PCR和三步法PCR一样，需要引物四条，引物设计也与三步法相同，只是在第一轮PCR获得产物L和R之后不再单独进行第二轮PCR，而直接在PCR体系中加入等mol的产物L和R，同时加入引物L1和R1，进行PCR扩增，大约35轮，即获得产物m用于下一步的克隆转化。

一步PCR法进行定点突变是目前很多公司所销售的定点突变试剂盒所采用的原理。但由于定点突变试剂盒即便是国产试剂盒也相对价格较贵，笔者认为完全可以自行购买试剂，没有必要购买试剂盒。

一步PCR法构建一个点突变，需要引物两条即上文所述的引物L2和R2，这两条引物是完全互补的两条引物，点突变位于引物中间，长度在28-36 bp之间，退火温度在78 ℃以上，GC含量超过40%。对于构建突变的模板，是带有完整未突变的目的片段的质粒载体，根据本人经验，以小于8 kb的克隆载体或表达载体为佳，以4-6 kb左右的克隆载体最好，因为整个载体都是扩增的模板，基于高保真聚合酶活力的限制，目的片段越长，扩增效率越差，对于过长的载体，其本身基因结构复杂，不利于扩增，即便是号称能够克隆17 kb的受托人stratagene的高保真酶对于长片段的扩增在普通PCR条件下也不容易。下面引用stratagene基因定点突变试剂盒的流程图对一步PCR法进行定点突变进行描述。

具体的，PCR反应体系：质粒模板20 ng，突变引物L2和R2（10 pmol/uL）各1 uL，dNTP（2.5 mM each）4 uL，高保真酶buffer 10* 5 uL，高保真酶（2.5U/uL）1uL，ddH2O补齐至50 uL。本人喜欢使用transgen的pfu酶，价格便宜，扩增的保真度和效率都不错。PCR反应条件参照stratagene的定点突变试剂盒。

一步法的PCR产物用识别甲基化位点的Dpn I限制性内切酶37 ℃酶切处理1 h，取10 uL的PCR产物用于转化，随机挑取单克隆进行测序验证。经过鉴定，在我的实验中，16循环的克隆数最佳，测序准确度也最高。

通过我自己多年总结经验和教训，我推荐想做定点突变的朋友首先选用一步PCR法进行突变实验，这种方法简便快捷，构建一个突变从引物设计到测序成功仅需7-10天时间，同时如果不使用试剂盒，费用也十分低廉。但是，经验告诉我，也不是所有的突变用一步PCR法都能很容易的成功，如果经过多次失败，也可以尝试采用两步或三步PCR法进行实验，后两种方法对于目的片段相对较长的基因可能更为有效。