主题：【原创】【极限体验】乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法

乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法

三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注。本方法适用于原料乳，也适用于不含添加物的液态乳制品。本方法定量检测范围为0.03mg/kg～100.0mg/kg。

本文参考了国标等标准并进行配制条件优化，建立了乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。

实验部分：

原理：

乳制品试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤萃取得到测试液，经高效液相色谱测定，根据紫外吸收光谱保留时间定性，峰面积进行定量计算。

仪器及设备：
1. 等度高效液相色谱系统（紫外检测器、柱温箱）
2. 分析天平
3. 离心机：转速不低于4000r/min，配50mL离心管
4. 超声清洗器
5. 涡漩混合器
6. 研钵（样品为奶酪，奶油和巧克力等时选用）
7. 固相萃取装置
8. 氮气吹干仪
9. 具塞塑料离心管
10. 真空泵和溶剂过滤器（过滤流动相用）
11. PH计：测量精度±0.2

试剂及材料：
1. 甲醇：色谱纯。
2. 乙腈：色谱纯。
3. 氨水：含量为25％～28％。
4. 三氯乙酸。
5. 柠檬酸。
6. 辛烷磺酸钠：色谱纯。
7. 三聚氰胺标准品：纯度大于99.0%
8. 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL。
9. 定性滤纸
10. 海砂：化学纯，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（SiO2）含量为99％（样品为奶酪，奶油和巧克力等时选用）。
11. 微孔滤膜：0.2μm，有机相
12. 氮气：纯度大于等于99.999％。
13. 一次性注射器标准品溶液配制：精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称50.0mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
样品前处理：
    称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀后超声提取15min。取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心5min，取上清液，滤纸虑过，固相萃取，氮气吹干，定容，0.22um滤膜过滤，作为HPLC测定溶液。

流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸）流速：1.0ml/min
  波长：240nm
  温度：40℃进样量：20μl

色谱图：

图1 三聚氰胺标准品

实验结果：精密度实验取浓度为0.5μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面积RSD为0.26％。
                                                        表1 精密度实验

标准曲线：

配置浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、6.0、15.0μg/mL的三聚氰胺标准工作液。将以上6种标准工作液在上述色谱条件下按浓度由低至高进样。用最小二乘法以对照品浓度(横坐标X轴，μg/ ml)对峰面积(纵坐标Y轴)进行线性回归，求算标准曲线。加样回收率和重现性实验

取已知三聚氰胺含量的酸奶样品，加入一定量的标准储备液，按“样品前处理” 操作，平行制备3份，得到样品溶液后按上述色谱条件进样分析，得到加样回收率及重现性结果，见表2。

图2 空白酸奶样品

图3 加酸奶样品

检测限及定量限：

依据噪声值，按3倍信噪比，计算其理论检出限，为0.021 mg/kg；按10倍信噪比，计算其定量限，为0.067 mg/kg。

结论：

本方法优化了高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺测定方法，该方法简化了前处理步骤，易于操作，线性关系良好，有较好的精密度和重现性，回收率满足国家标准的要求，检出限和定量限也符合目前三聚氰胺的检测要求，适用于乳制品检测，可作为鸡蛋、饲料等检测参考。