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主题：【分享】蛋白样品污染C18色谱柱的冲洗方法

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zy178

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发表于：2013/06/21 22:11:54 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

跟大家分享一个蛋白样品污染C18色谱柱的售后：

客户做蛋白样品，进了第7针样的时候，峰开始分叉（见下图）

安谱收到色谱柱后测了柱效,柱效只有3000左右（出厂柱效为15000）（见下图）

之后进行了修复：1.清洗筛板，2.反冲:85%乙腈：1%三氟乙酸水溶液，0.3ml/min过夜，后15%的乙腈：水，冲洗3h.，测柱效12300（见下图）

经过修复后柱效显著增加。

向各位请教几个问题，将来我会把各位的答案汇总在这里以便大家今后实验时做参考，都是些基本问题，但是比较有代表性，望大伙共同提高。

1、为何要清洗筛板？

2、蛋白样品是否特别容易损坏色谱柱，进7针就有问题了？

3、反冲对色谱柱有影响吗，这样操作是否对？

4、蛋白污染的样品为何要加三氟乙酸？

5、过夜后为何要用15%的乙腈：水冲洗3h？

6、测柱效的重要性有哪些？

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2013/6/22 9:06:30 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

很有参考价值的修复手段，我来回答一下，以作抛砖引玉。

污染物积累在筛板上，清洗筛板和反冲有效。

蛋白质遇到有机相变性析出，堵在柱头端。

柱两端的筛板大小一样，柱床填得紧密的柱子，小流量反冲无影响。

三氟乙酸是离子对试剂，增加蛋白质溶解性？

冲洗3h是为了除掉三氟乙酸？

测定柱效确定柱子本身有没有问题。

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lwzzyj

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2013/6/22 23:52:28 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

如果分岔是由于筛板被部分阻塞造成的，那么清洗筛板就是必要的，而且伴随分岔可能柱压也增加。

如果柱压没有增加，可能就是柱头处的填料吸附了蛋白，那么加酸反冲就应该有效果。反冲的话，色谱柱两端筛板的孔径必须要是一致的，流速要小，否则反冲也会导致柱头塌陷。

加酸破坏蛋白的三级结构，对破坏填料对蛋白的吸附会有用。

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houjjun

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2013/6/23 13:41:09 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

可能是造成柱效下降了

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vcningmeng

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2013/6/24 9:40:29 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、对于筛板的清洗，我同意TANGTANG老师的看法，主要还是污染物在筛板上聚集了，或者堵住了筛板，造成了筛板部分孔径是通的，部分是不通的，这样进样以后，样品不是从一个平面进入柱子，导致峰拖尾。

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2013/6/24 9:41:09 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 vcningmeng(vcningmeng) 发表:
1、对于筛板的清洗，我同意TANGTANG老师的看法，主要还是污染物在筛板上聚集了，或者堵住了筛板，造成了筛板部分孔径是通的，部分是不通的，这样进样以后，样品不是从一个平面进入柱子，导致峰拖尾。

很多时候由于筛板的污染，造成了峰拖尾。

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2013/6/24 9:44:11 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2、蛋白样品是否特别容易损坏色谱柱，进7针就有问题了？
这个问题比较复杂，
比如说蛋白溶解的液体，流动相的配比，都有关系，蛋白在流动相中会不会重新凝结或者团聚？这个都是要考虑的问题。
一般来说如果C18的吸附太强的话，是不是可以考虑用C8或者C4，甚至是C2?

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zy178

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2013/6/24 10:30:10 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 vcningmeng(vcningmeng) 发表:
2、蛋白样品是否特别容易损坏色谱柱，进7针就有问题了？
这个问题比较复杂，
比如说蛋白溶解的液体，流动相的配比，都有关系，蛋白在流动相中会不会重新凝结或者团聚？这个都是要考虑的问题。
一般来说如果C18的吸附太强的话，是不是可以考虑用C8或者C4，甚至是C2?

总结蛋白样品容易破坏色谱柱可能有三个原因：

A、蛋白样品一般是从植物或动物组织中提取纯化的，杂质比较复杂，如果客户处理不得当，会很快损坏柱子，比如没有高速离心或者用针式滤器过滤颗粒物，从而导致筛板堵塞；或者其它非极性小分子杂质与填料发生作用，损坏了固定相。

B、蛋白样品不溶于流动相，重新凝集，尤其是有机溶剂（如tangtang老师所说，蛋白质遇到有机相变性析出，堵在柱头端）

C、蛋白有很多种，有极性大的和极性较小的蛋白，小极性蛋白会吸附在填料上影响分离（如vcningmeng老师所说，可以考虑用C8或者C4，甚至是C2）。

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2013/6/24 10:33:24 Last edit by zy178