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透射电镜（TEM）
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主题：求助：小鼠囊胚透射电镜样品制备

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2006/11/14 8:46:00 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
小鼠囊胚我想应该很小，不会超过1立方毫米吧？按正常的生物电镜标本处理应该没有问题。步骤：2.5％戊二醛固定2小时，0.1M PBS冲洗2~3次，每次20分钟，然后1％OsO4固定30分钟左右（视标本具体大小吧，小固定时间可以更短点。从前我室固定标本锇酸总是用2小时，最近几年不知什么原因，也许气候变了？2小时锇酸固定后标本基本上都脆了，无法切片，后来把固定时间缩短至40分钟左右就没问题了），剃度酒精脱水，每步5分钟（参考书上都是10~20分钟，以我二十多年经验和实际操作效果，5分钟足够了），至90％酒精后，再改换90％酒精丙酮，90％丙酮，100％丙酮2次，均用5分钟，然后半浸透（纯丙酮＋812 1：1）2小时，全浸透2小时，然后进60度烤箱过夜即可切片了。

建议不要用二甲砷酸钠缓冲液，毒性大。
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zhuomuniao
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2006/11/14 14:47:00 12楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
呵呵！太感谢了！又学到不少知识！ 老师，小鼠囊胚的直径为100um左右，是个圆球，不经染色肉眼几乎看不到，所以从固定到脱水我必须在体式镜下操作，用吸胚针将胚胎从一种溶液中转移到另外一种溶液中,不过我想经锇酸固定后胚胎就变成黑的了，应该能看到了。
  还有一个问题：是是不是胚胎从胚胎液中取出后一直到渗透前都要在4度冰箱中进行?
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zhuomuniao
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2006/11/14 15:02:00 13楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢你，JJ！我会努力的。等我做好了把经验也传给大家！
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2006/11/14 20:40:00 14楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
晕了，又遇上了一个单细胞电镜标本制作的。根据你的标本情况，你的样本戊二醛固定时间5分钟，冲洗3次，每次5分钟，然后从锇酸固定开始至脱水完毕所有步骤都只能采用1分钟，特别锇酸固定，千万千万只能用1分钟，切记！
锇酸固定完毕后只能说标本变成浅褐色，因为样本实在太小。半浸透10分钟，全浸透半小时，之后进60度烤箱过夜即可。
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2006/11/14 20:49:00 15楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
忘了说了，所有操作均室温进行，不需要4°C下操作。
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2006/11/15 8:53:00 16楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢，老师！但是我还有几个疑问：
1.小鼠囊胚虽然很小，但可以说是一个完整的生命个体，外面有一层致密的透明带包围，里面大约有100多细胞。如果在室温下短时间内进行固定，脱水，渗透，固定液，脱水剂，812包埋剂能够渗透到胚胎中吗？
2.透射电镜样品制备讲究一个“冷”，如果都在室温下进行，细胞的超微结构能保存完好吗？
  请老师指教！
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2006/11/15 11:48:00 17楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
如果按教科书的教条来，所有标本都在低温下进行，电镜标本的制作成本不知道又会高多少了。放心吧，室温下制作是没有问题的。
我的时间是给你一个参考。一般来说应该是可以的，如果你不放心，预作1个标本看看。没有人能保证一次成功，我做也不能打包票。问得再详细也没用，关键是你自己动手，在动手过程中总结经验，别人的永远只能是参考。
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2006/11/15 15:25:00 18楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
,太谢谢了！老师，我会努力的。我还有一个问题就是：
1.丙酮与812包埋剂1：1混合时，及纯的812包埋剂渗透时，这两种812是不是都不加加速剂DMP-30？
2.812包埋剂可以先配好吗？储存在什么条件下？
3.包埋时，在平板包埋板中先加样品，还是先加包埋剂？
  请老师指教！谢谢！
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2006/11/15 16:35:00 19楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
812是事先配好的，当然已经加入了DMP-30。
我们平时使用812都是事先配好比如100ml，然后分装到青霉素小瓶中放入冰箱冷冻室，用时提前半小时取出。
先加包埋剂。
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2006/11/15 17:01:00 20楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢，老师，与丙酮混合及渗透用的812都是完全的吗？
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