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液相色谱（LC）

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主题：【第六届原创】LC 设备确认

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wodedipan

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药物分析发表于：2013/08/23 13:46:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪确认方案

一、概述

高效液相色谱仪是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，由色谱工作站软件记录和数据处理装置记录色谱图进行数据处理，得到测定结果。具有分离性能高、分析速度快的特点。Ultimate3000型高效液相色谱仪配置由双三元输液泵、脱气机、自动进样器、色谱柱柱温箱、可变波长扫描紫外检测器、二极管阵列检测器和色谱数据处理化学工作站组成。

二、再确认目的

通过对Ultimate3000型高效液相色谱仪的运行确认、性能确认进行检查和再确认，以证明该仪器仍能符合所制定的标准及文件符合GMP要求，确保液相色谱检查法的准确性。

三、再确认范围

本次再确认方案适用于实验室的Ultimate3000型高效液相色谱仪，再确认范围包括运行再确认、性能再确认。

四、再验证组织分工及职责

职务	姓名	岗位	职责
组长	负责再验证方案的审核、批准及再验证合格证书发放。
副组长	负责再验证方案审核，组织协调整个再验证工作；负责组织相关的再验证培训。
副组长	负责再验证方案的审核及再验证项目总结；组织协调本部门人员具体实施并监督再验证工作；负责再验证过程中偏差及异常情况处理；负责再验证文件的档案管理；参加再验证结果的评价。
组员	负责再验证仪器、设备正常运转的电、水等供应；组织仪器、设备故障性维修，并填写维修记录；制订预防性校正、维护计划。
	负责再验证方案的起草；保证具体再验证方案的有效进行；负责再验证数据真实性汇总并编写再验证报告。
	监督再验证实施过程，保证再验证方案有效执行。
	负责再验证的具体操作工作及时填写记录；发生偏差及时上报。

五、再确认参考资料

《中国药典》（2010年版）

《药品生产质量管理规范》（2010年版）

中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪（JJG705-2002）

Ultimate3000高效液相色谱仪溶液传输单元说明书

Ultimate3000高效液相色谱仪可变波长扫描紫外检测器（VWD）说明书

Ultimate3000高效液相色谱仪二极管阵列检测器（DAD）说明书

Ultimate3000高效液相色谱仪操作说明书

Ultimate3000高效液相色谱仪安装手册

Ultimate3000高效液相色谱仪维修手册

六、再确认内容

6.1 确认目的：运行确认和性能确认在一个阶段进行测试，以证明该仪器的各部件测试标准与供应商提供的相一致，仍符合精密仪器检验要求。

6.2 仪器各单元开机性能再确认

6.1仪器技术说明

确认项目	确认值	确认结果
确认项目	确认值	是	否
仪器名称	高效液相色谱仪	□	□
仪器型号	Dionex3000	□	□
设备编号	ZB-HY-187	□	□
校准状态	合格	□	□
脱气机序列号	8049183	□	□
脱气机型号	SRD-3600	□	□
脱气机部件号	5035 .9230	□	□
六元泵序列号	8048975	□	□
六元泵型号	DGP-3600SD	□	□
六元泵部件号	5040. 0061	□	□
安全接线	220V~240V/2AT或100V~120V/2AT 150VA 50~60Hz	□	□
自动进样器序列号	8050274	□	□
自动进样器型号	WPS-3000SL ANALYTICAL	□	□
自动进样器部件号	5822 .0010	□	□
柱温箱序列号	8046964	□	□
柱温箱型号	TCC-3000RS	□	□
柱温箱部件号	5730. 0000	□	□
VWD检测器序列号	8048539	□	□
VWD检测器型号	VWD-3100	□	□
VWD检测器部件号	5074.0005	□	□
DAD检测器序列号	8049485	□	□
DAD检测器型号	DAD-3000	□	□
DAD检测器部件号	5082.0010	□	□
固件系统版本号	Version 7.1.0.898	□	□
联机电脑配置	Windows 7 PC系统，AMD A8-3850 APU With Radeon（tm）HD Graphics处理器，4.0GB内存，2.9GHz，显示器分辨率1920×1080。	□	□
打印机型号	惠普 1020	□	□
电源电压	AC220V±10%	□	□
工作环境	实验环境湿度20~30℃	□	□
生产厂家	安捷伦科技有限公司	□	□
仪器位置	质保部中心化验精密仪器室	□	□
EHS检查	应符合新版GMP规范要求	□	□

外观检查：

项目	开关功能键再确认	再确认结果
输液泵及进样器	打开电源开关，泵及进样器进行自检，并显示置主界面。	是□	否□
检测器	打开电源开关，检测器灯打开，并进行自检，氘灯在3个内置波长257、521、656nm处的校准，若偏差小于±1nm，自检通过，若大于1nm，出现自检错误提示。	是□	否□
结论：
检查人：年月日复核人：年月日

6.3 六元输液泵的检测

6.3.1输液泵耐压性检查

将仪器各部分连接好，以纯化水为流动相，流量设为1.0ml/min，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，用滤纸检查各管路接口处应无湿迹，卸下色谱柱，堵住泵出口端（压力传感器以下），使压力达到最大允许值的90%，保持5分钟，应无泄漏。

合格标准：压力范围达到最大允许值的90%时，应无泄漏。

6.3.2输液泵泵流量准确度和精密度的检测

将仪器各部分连接好，以纯化水为流动相，流量设为1.0ml/min，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗精密称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，在分析天平上称重。按式(1)、式(2)计算 S_S和 S_R。

流量设定值（ml/min）	0.5	1.0	2.0
测量次数	3	3	3
流动相收集时间（min）	10	5	5

S_S＝︱(F_m－F_S)︱/F_S×100%……(1)

S_R＝(F_max－F_min)/F×100%……(2)

式中：S_S——流量设定值误差(％)；

S_R——流量稳定性误差(％)；

F_m＝(W₂－W₁)/ (ρ_T·t) 流量实测值(ml/min)；

W₂——容量瓶＋流动相的重量(g)；

W₁——容量瓶的重量(g)；

F_S——流量设定值(ml/min)；

ρ_T——实验温度下流动相的密度(g/cm³)；

t——收集流动相的时间(min)；

F_max——同一组测量中流量最大值(ml/min)；

F_min——同一组测量中流量最小值(ml/min)；

F——同一组测量值的算术平均值(ml/min)。

六元输液泵流量设定值误差S_S、流量稳定性误差S_R的检测记录表

F_S

0.5ml/min

1.0ml/min

2.0ml/min

第一次

第二次

第三次

第一次

第二次

第三次

第一次

第二次

第三次

W₁

W₂

ρ_T

F_m

S_S

平均S_S

F_max

F_min

S_R

0.5 ml/min

1.0 ml/min

2.0 ml/min

流量准确度 S_S

标准值

应≤5%

标准值

应≤3%

标准值

应≤5%

实测值

结论

流量精密度S_R

标准值

应≤0.3%

标准值

应≤0.2%

标准值

应≤0.5%

实测值

结论

测试人：年月日复核人：年月日

6.3.3梯度误差准确度的检定

在输液泵设置阶梯式的梯度洗脱程序，A溶剂为新制的超纯水，B溶剂为含0.1%丙酮的水溶液，B经由5个阶梯从0变到100%，如图2所示。将输液泵和检测器连接(不接色谱柱)，开机后以A溶剂冲洗系统，基线平稳后开始执行梯度程序，画出梯度变化曲线。求出A, B溶剂不同比例时的输出信号值(或记录仪读数)，重复测量2次，计算平均值。从B溶剂的含量及对应的输出信号值(或记录仪读数)，按式(3)计算梯度误差Gci，取Gci最大者作为仪器梯度误差。

Gci =( L_i 一L_m)/ L_m×100 %……(3 )

式中：Gci—第i段梯度误差(%)；

L i—第 i 段输出信号值(或记录仪读数)平均值；

L_m—各段输出信号(或记录仪读数)平均值的平均值。

梯度误差准确度的检定原始记录见附录（13.2）。

6.3.4柱温箱柱箱温度准确度和控温稳定性的检定

将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择35℃和45℃进行检定。按仪器说明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后每隔10min记录一次读数，共计7次，求出平均值。平均值与设定值之差为ΔT_S，7次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性T_C。

柱温箱柱箱温度设定值误差ΔT_S和控温稳定性T_C的检定原始记录见附录（13.3）。

6.3.5紫外-可见分光检测器检定

检测器基线噪声和基线漂移的测定

取C₁₈色谱柱，以100%纯甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm，开机预热，待仪器稳定后（约60min）记录基线60min，从30min内基线上读出噪音值；从60min基线上读出基线漂移值。

检测器最小检测浓度的检定

取C₁₈色谱柱，以100%纯甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，紫外可见光检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后取1×10^-7g/ml的萘/甲醇溶液进样20μl，记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声峰峰高计算最小检测浓度C_L。

C_L=(2×N_d×CV)/20H……(4 )

式中C_L——最小检测浓度，g/ml； N_d——基线噪声峰峰高，mm；

C——标准溶液浓度，g/ml； H——标准溶液峰峰高，mm。

检测器线性范围准确度的检定

将工作站与检测器的连接好，检测器的波长选在254nm，用洁净的注射器直接向检测池中注射2%异丙醇水溶液冲洗检测池，记下工作站中的数值。按此法分别注入100%纯丙酮（丙酮含量为0.1%、0.2%……1.0%）冲洗检测池，并分别记下各溶液对应的稳定数值，连续重复测量3次，计算平均值。

检测器性能检定的原始记录见附录

6.36波长示值误差及重复性检定

将仪器接通光源自检，通电预热稳定后，运用氘灯将紫外波长标准溶液的特征波长（235nm、257nm、313nm、350nm），用一节空管代替色谱柱将液路连通，以高纯水做流动相，流量为1.0 mL/min，采用步进进样方法，例如检定257 nm时，从252n开始到262nm，每2min改变1 nm，用注射器注入紫外吸收标准溶液10μl，这样将得到一组不同波长的色谱峰记录波长示值，与标准示值比较，以示值误差来判断波长的准确度和重复性。

6.3.5自动进样器进样量准确度误差的检测

取1.5ml进样瓶装入1ml水，用天平精密称定其重量，然后置于自动进样器上让其进样10次，每次50μl。进样完成后再精密称定其重量，由重量差计算进样量准确度。（附10次进样的色谱图）

合格标准：进样量准确度误差应≤1.0%

自动进样器进样量准确度误差检测记录表

液相色谱仪型号	自动进样器型号	自动进样器序列号
柱温箱温度℃	水的密度ρ	g/ml	环境温度	相对湿度
进样前进样瓶加水的总重W₁	进样后进样瓶加水的总重W₂
进样量准确度误差的计算[︱(W₁- W₂)｜-(50×10×10^-3×ρ)]/（50×10×10^-3×ρ）×100%
结论：
测试人：年月日复核人：年月日

6.4 整机性能的检定

取C₁₈色谱柱，以100%纯甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm，柱温设定为40℃。开机预热待仪器稳定后取0.1mg/ml的萘/甲醇溶液进样10μl，连续进样6次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其定性测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差。（附6次标准溶液的色谱图）

合格标准：定性测量重复性(6次)误差：RSD≤0.5%；

定量测量重复性(6次)误差：RSD≤1.0%

整机性能的检定记录表

定性测定（保留时间）	定量测定（峰面积）
第一次
第二次
第三次
第四次
第五次
第六次
平均值
测量误差的RSD% （采用EXCEL函数表格计算）
结论：
测试人：年月日复核人：年月日

6.5 运行再确认与性能再确认结果分析与批准

七、偏差与变更处理

再确认过程中如果出现偏差和变更，应立即通知再验证小组并对偏差和变更进行详细记录（参见偏差处理单（编号），变更处理单（编号）），分析偏差产生的根本原因并提出解决方法。所有偏差和变更得到有效处理后，再确认方可进入下一步骤。偏差处理单和变更处理单经过批准后其原件必须附在再确认报告中。

八、再确认建议

8.1 仪器正常使用满一年后，必须进行再确认。

8.2 仪器进行重大维修或更换关键部件后，必须及时进行再确认。

8.3 仪器的安装地点发生变化后，必须及时进行再确认。

8.4 测试数据出现偏差、超出标准要求或数据趋势分析有异常时，必须及时进行再确认。

8.5 定期重复执行性能确认的全部或部分测试，进行确认状态的回顾评估，如偏离确认状态应及时进行仪器再确认。

十一、本次确认结论

9.1 根据本次整体再确认实际结果，明确该仪器整体再确认工作是否结束。

9.2本次再确认结束后，对再确认结果进行评价和建议，做出本次再确认结论，对在确认结果的评价应包括：

9.2.1本次再确认测试项目是否有遗漏；

9.2.2本次再确认实施过程中，对再确认方案，有无修改，修改原因依据及是否经批准；

9.2.3本次再确认记录是否完整；

9.2.4本次再确认测试结果是否符合标准要求。偏差及对偏差的说明是否合理，是否需要进一步补充实施。

附录一

六元输液泵流量设定值误差S_S、流量稳定性误差S_R的检定原始记录

液相色谱仪型号：泵型号：流动相：色谱柱: 检定人/日期：复核人/日期：
F_S	0.5ml/min			1.0ml/min			2.0ml/min
第一次	第二次	第三次	第一次	第二次	第三次	第一次	第二次	第三次
W₁
W₂
t
T
ρ_T
F_m＝(W₂－W₁)/ ρ_T·t
S_S＝(F_m－F_S)/F_S×100%
平均S_S
F=（F_m1+ F_m2+ F_m3）/3
F_max
F_min
S_R＝(F_max－F_min)/F×100%

此项检查结论：

检查人/日期：复核人/日期

附录二

梯度误差准确度的检定原始记录

B溶液变化范围		0%	20%	40%	60%	80%	100%
记录仪读数	1
	2
	L i
L_i 一L_m
Gci

此项检定结论：

检查人/日期：复核人/日期：

附录三

柱温箱柱箱温度设定值误差ΔT_S和控温稳定性T_C的检定原始记录

液相色谱仪型号：柱温箱型号：数字温度仪型号：
T_设定	35℃		45℃
时间	读数	时间	读数
稳定时
第1次
第2次
第3次
第4次
第5次
第6次
第7次
T平均
T最大
T最小
ΔT_S= T_平均- T_设定
T_C= T_最大- T_最小

此项检定结论：

检查人/日期：复核人/日期：

附录四

检测器性能检定原始记录

仪器型号

检测器型号

检测器序列号

色谱柱型号

柱长

波长范围

波长示值误差

235nm

257nm

313nm

350nm

波长重复性

235nm

257nm

313nm

350nm

基线噪声

基线漂移

最小检测浓度

最小检测浓度的计算C_L=(2×N_d×CV)/20H

线性范围

丙酮（%）

次数

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

读

数

平均值

此项检定结论：

检定人/日期：复核人/日期：

附录五

自动进样器进样量准确度误差的检定原始记录

液相色谱仪型号	自动进样器型号	自动进样器序列号
柱温箱温度℃	水的密度ρ	g/ml	环境温度	相对湿度
进样前进样瓶加水的总重W₁	进样后进样瓶加水的总重W₂
进样量准确度误差=[(W₁- W₂)-(50×10×10^-3×ρ)]/（50×10×10^-3×ρ）×100% 计算如下：

此项检定结论：

检查人/日期：复核人/日期：

附录六

整机性能的检定原始记录

仪器型号：流动相：流速：色谱柱型号：检测波长：进样量：标准溶液类型：浓度：配制人：配制时间：
定性测定（保留时间）	定量测定（峰面积）
第一次
第二次
第三次
第四次
第五次
第六次
平均值
测量误差的RSD