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主题：【分享】微生物对黑土添加麦秸后腐殖质结构特征影响的红外光谱研究

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发表于：2013/08/28 09:53:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

引言

　　土壤有机质（ＳＯＭ）是土壤中具有结构性和生物性的基本物质，既是生命活动的条件，也是生命活动的产物。从化学本质角度，ＳＯＭ中６０％～９０％为腐殖物质（ＨＳ），因此ＨＳ是ＳＯＭ研究的核心和主体。ＨＳ是经土壤微生物作用后，由多酚和多醌类物质聚合而成、含芳香环结构和脂族特征、新形成的一系列黑色至棕黑色的非晶形准高分子有机化合物，其形成与转化对土壤肥力、固碳和环境解毒均有重要意义。

众所周知，微生物是土壤中最为活跃的部分，它们参与土壤有机质的分解、腐殖质的合成以及养分元素的转化。ＨＳ的形成是以微生物为主导的生物化学过程，但不同微生物种类对土壤ＨＳ结构和性质的影响目前还知之甚少，尤其是外源添加有机物料，经过微生物培养后，ＨＳ各组分的结构和性质是否发生变化，更不得而知。本研究针对这一问题，采用红外光谱法研究黑土添加麦秸后，接种不同种类微生物（细菌、真菌、放线菌和混合菌）培养１８０ｄ，针对土壤中水溶性物质（ＷＳＳ）、富里酸（ＦＡ）和胡敏酸（ＨＡ）特征峰和吸收强度的变化，旨在探索微生物在ＨＳ形成方面的作用及其转化机理，为有效培肥土壤、增大土壤环境承载力、促进碳循环提供理论参考和基础保障。

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2013/8/28 9:53:47 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

１实验部分

１１材料

（１）黑土：于２００９年１０月，采自吉林农业大学校区长伊公路东侧台地耕层土壤（Ｎ４３°４８′４４″；Ｅ１２５°２３′４５″），该地块长期单一种植玉米，有机质、全氮、全磷分别为１７．５８，１．１，０．７１ｇ·ｋｇ－１，ｐＨ值为６．２７。

（２）有机物料：小麦秸秆采集地与上述地块相邻，秋收后，将其剪成适当大小，在５０～７０℃条件下烘干，经粉碎过０．２５ｍｍ筛，其有机碳、全氮、Ｈ含量分别为４１６．４，８．２，７．２ｇ·ｋｇ^－１和Ｃ/Ｎ比78。

（３）菌悬液配制：供试菌株均源于供试黑土，经分离、纯化、扩培和刮取后制成一定浓度的菌悬液。细菌悬液由枯草芽孢菌和巨大芽孢杆菌组成，放线菌悬液由孢囊链霉菌和链霉菌组成；真菌悬液由木霉、青霉和黑曲霉组成。

１.２微生物培养及腐殖质组分的提取

１.２.１微生物培养

称取过２ｍｍ筛的黑土７.５ｋｇ，按土重４％加入麦秸粉末，混合均匀后，用硫酸铵调节Ｃ／Ｎ比约为２０（促使微生物发挥最大活性），按每瓶５０ｇ土分装至１００ｍＬ三角瓶中，调节土壤含水量至田间最大持水量的７０％～８０％，加棉塞后进行间歇式灭菌，直至灭菌彻底。实验共设５个处理：（Ａ）接种细菌悬液；（Ｂ）接种放线菌悬液；（Ｃ）接种真菌悬液；（Ｄ）将上述细菌、放线菌和真菌悬液按等比例混合，制成混合菌悬液后接种；上述Ａ～Ｄ处理悬液接种量均为每瓶１０ｍＬ；（Ｅ）无菌，仅加１０ｍＬ无菌水。上述处理均设三次重复，培养实验在２８℃条件下进行，定期称重补水确保混合物含水量恒定。１８０天培养后，取样，５０℃烘干、磨细、备用。

１.２.２ＷＳＳ，ＦＡ和ＨＡ的分离及提取

（１）ＷＳＳ：将过１ｍｍ筛的１００ｇ风干土按土液比１∶１０的比例，室温下置于玻璃瓶中，Ｎ２条件下提取２４ｈ，将提取液用虹吸法吸出，提取液即为ＷＳＳ。

（２）ＦＡ和ＨＡ：经蒸馏水除去ＷＳＳ和水浮物后的土壤样品，用０．１ｍｏｌ·Ｌ^－１ＮａＯＨ＋０．１ｍｏｌ·Ｌ^－１Ｎａ２Ｐ２Ｏ７混合液在７０℃条件下提取１ｈ，提取液即为可提取腐殖质（ＨＥ）。该提取液经０．５ｍｏｌ·Ｌ^－１Ｈ２ＳＯ４酸化至ｐＨ１．０，溶液即为粗ＦＡ，沉淀为粗ＨＡ。将粗ＨＡ沉淀用１∶１ＨCl调至ｐＨ７．０，高速离心去除粘粒，反复溶解两次后注入半透膜中透析，待ＡｇＮＯ₃检测仅出现少量白色沉淀后转入电渗析仪中，至电流很小且阴极室无酚酞反应为止。将渗析纯化好的ＨＡ溶液进行旋转蒸发缩小体积，然后转入塑料烧杯中，置于冷冻干燥机中冻干，即可得纯ＨＡ固体样品。将粗ＦＡ溶液通过铺于布氏漏斗的活性碳层（活性炭用０．５ｍｏｌ·Ｌ^－１ＮａＨＣＯ３溶液多次淋洗，再用水洗近中性），待渗出液无色后，弃去滤液，再用０．２ｍｏｌ·Ｌ^－１ＮａＯＨ溶液洗涤活性碳层，洗脱出的物质即为ＦＡ，再将ＦＡ组分用１:１ＨＣｌ调至中性，经渗析、浓缩、冷冻干燥后即得纯ＦＡ固体样品。

１.３光谱实验

将冻干后的ＷＳＳ，ＦＡ和ＨＡ样品，用ＫＢｒ压片，在美国ＮｉｃｏｌｅｔＡＶ３６０红外光谱仪上进行测定，波数范围为４０００～４００ｃｍ^－１，分辨率为４ｃｍ^－１，扫描次数为１６，谱图采用ＯｍｎｉｃＶｅｒｓｉｏｎ４．１软件包进行分析。

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2013/8/28 9:54:39 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

２结果与讨论

２.１不同微生物处理对黑土犠犛犛的影响

由图１可知，经不同微生物培养的土壤样品，其ＷＳＳ组分的红外谱图与空白间存在较大差异，尤其在指纹区（１８００～９００ｃｍ^－１）差异更为显著，可见，外源添加微生物对ＷＳＳ组分的特征峰及其吸收强度可产生重大影响。

参照Ｄｒｏｕｓｓｉ等［３］的研究结果，ＷＳＳ组分的特征峰归属如下：３４００ｃｍ^－１（Ｏ-Ｈ的伸缩振动或氨化物和胺类Ｎ-Ｈ的伸缩振动［４］），２９２０和２８５０ｃｍ^－１（ＣＨ２的反对称伸缩振动或Ｃ-Ｈ的对称伸缩振动），１７２０ｃｍ^－１（羧基Ｃ-Ｏ的伸缩振动），１６２０ｃｍ^－１（芳香族Ｃ-Ｃ的骨架振动或醌和氨基化合物的Ｃ-Ｏ振动，亦或氢键结合共轭酮的Ｃ-Ｏ振动），１４２０ｃｍ^－１（酚羟基Ｏ-Ｈ的变形振动和Ｃ-Ｏ的伸缩振动），１２３０ｃｍ^－１（芳基醚、酚的Ｃ-Ｏ振动或羧酸的Ｃ-Ｏ伸缩和ＯＨ变形振动［５，６］），１１２２ｃｍ^－１（醇或醚的Ｃ-Ｏ振动）和１０３４ｃｍ^－１（多糖或类多糖物质的Ｃ-Ｏ振动）。

ＷＳＳ组分的谱图中未见１５１７ｃｍ^－１（氨基化合物Ｎ-Ｈ的变形振动或Ｃ寥/font]Ｎ的伸缩振动）和１３７１ｃｍ^－１（酚羟基Ｏ-Ｈ的变形振动和Ｃ-Ｏ的伸缩振动或ＣＯＯ^－的反对称振动）两处峰，这也许是因为ＷＳＳ组分中氨基化合物和芳基醚在培养过程中被微生物迅速降解所致。

结合半定量分析结果（表１）可知，与空白Ｅ相比，Ａ～Ｄ处理３４００ｃｍ^－１宽峰吸收强度均较弱，具体顺序为真菌＞混合菌＞细菌＞放线菌。可见，微生物可有效减少土壤ＷＳＳ组分中羟基的含量，真菌对羟基的消耗最小，而放线菌对其消耗最大。３４００／２９２０比值大小依次为混合菌＞真菌＞无菌＞放线菌＞细菌，经细菌培养后的土壤，其ＷＳＳ组分中含有较多脂肪族烷烃类物质。Ｚｈａｎｇ等研究认为２９２０，２８５０和１４６０～１４５０ｃｍ^－１吸收峰应归属于脂族Ｃ-Ｈ的伸缩振动，三个峰的强度可表征ＨＳ中脂族化合物的含量。结合本研究可判断，与空白相比，细菌处理ＷＳＳ组分中的脂族类物质有所提高，而此类物质经放线菌、真菌和混合菌培养后均有减少趋势，减幅最大的为混合菌处理。与其他微生物处理相比，经真菌培养后土壤的ＷＳＳ组分，其１６２０和３４００ｃｍ^－１两吸收峰尤为突出，表明其含有较多的酚类物质，但却远低于空白，这表明真菌在培养过程中对ＷＳＳ组分中酚类物质的消耗低于其他三个处理，按消耗作用大小依次为放线菌＞细菌＞混合菌＞真菌，可见，放线菌在土壤中对ＷＳＳ组分中酚类物质的消耗最大。由Ｅ至Ａ处理，１７２０ｃｍ^－１吸收峰从无到有，可判断：接种微生物有利于提高土壤ＷＳＳ组分中羧基的含量，其中细菌和放线菌的作用较大。１０３４ｃｍ^－１吸收峰在接种微生物培养１８０ｄ后，其吸收强度显著降低，由Ａ至Ｄ处理分别减少９９．４６％，９９．５４％，９９．３８％和９９．６０％，可见微生物在培养过程中几乎消耗了ＷＳＳ组分中全部多聚糖，混合菌的消耗作用最大。

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2013/8/28 10:06:57 Last edit by 012304

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2013/8/28 9:55:17 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

２.２不同微生物处理对黑土犉犃的影响

如图２所示，土壤ＦＡ经微生物培养后，无论是峰位还是吸收强度均无明显变化。１７２０和１４３０ｃｍ^－１吸收峰，前者代表羧酸的Ｃ-Ｏ振动，后者代表ＣＯＯＨ的Ｃ-Ｏ伸缩和Ｏ-Ｈ变形振动以及苯酚Ｃ-Ｏ的伸缩振动，而１６００ｃｍ^－１附近的吸收峰是由于芳香结构的Ｃ寥/font]Ｃ振动和氢键结合共轭酮的Ｃ寥/font]Ｏ振动所引起的，１２３０ｃｍ^－１处峰既可代表芳基醚和酚类的Ｃ-Ｏ振动，也可代表羧酸的Ｃ-Ｏ伸缩振动和Ｏ-Ｈ变形振动，１０８０～１０３０ｃｍ^－１区间内的吸收峰应归属于多糖的Ｃ-Ｏ伸缩振动。

由表２可知，土壤ＦＡ组分３４００ｃｍ^－１吸收峰在接种微生物培养后强度均有不同程度降低，降幅由大到小依次为放线菌＞真菌＞细菌＞混合菌，表明放线菌在减少土壤ＦＡ组分中羟基含量的能力最大，其次为真菌，混合菌最弱。Ｃｈａｉ等采用红外光谱法研究填埋厂垃圾中所提取的ＨＳ组分，发现ＦＡ在填埋过程中，脂族Ｃ-Ｈ的伸缩振动（２９４０ｃｍ^－１）和羧基的Ｃ寥/font]Ｏ振动（１７２０ｃｍ^－１）均有降低趋势，而１６５０ｃｍ^－１处吸收峰强度有所增强，由此可知：ＦＡ组分中的羧基可被微生物酶及其氧化作用分解为小而多的ＦＡ分子的子单位，而这一结论恰好与本文结果相悖，这表明在本研究中ＦＡ在分解的同时又被合成，ＷＳＳ合成或ＨＡ分解所形成的新的ＦＡ分子可部分掩饰原有ＦＡ分子的分解过程。真菌培养土壤的ＦＡ组分２９２０和１７２０ｃｍ^－１峰面积增幅最大，而１６００ｃｍ^－１峰面积降幅最大，说明真菌对土壤ＦＡ组分的“净生成能力”最强。另外，真菌处理土壤ＦＡ组分２９２０和２８５０ｃｍ^－１两峰吸收强度均有所提高，说明此时ＦＡ组分正发生脱聚合作用［９］，这与外源添加麦秸的腐解有关。ＦＡ组分１７２０ｃｍ^－１的尖锐吸收峰，表明其结构中含有大量羧基。接种微生物培养后，ＦＡ组分１７２０ｃｍ^－１吸收峰均有不同程度增强，依次为Ｃ＞Ｂ＞Ａ＞Ｄ，由此可见，真菌培养后土壤ＦＡ组分的羧基含量最多，其次为放线菌，混合菌影响最小，但其ＦＡ组分中羧基含量仍略高于空白。真菌培养土壤的ＦＡ组分１０３４ｃｍ^－１的吸收峰强于其他各处理，表明ＦＡ分子中含有较多碳水化合物结构，其次为混合菌，细菌处理影响最小。由１０３４／２９２０比值结果可知，细菌、放线菌和真菌培养均有利于土壤ＦＡ组分中多糖的降解和脂类的分解，而混合菌的作用恰好相反。

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2013/8/28 10:07:44 Last edit by 012304

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2013/8/28 9:56:02 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

２．３不同微生物对黑土犎犃的影响

如图３所示，不同微生物处理土壤ＨＡ组分的红外谱图与空白相比，在指纹区峰强度略有变化。以空白为例，３４００ｃｍ^－１宽峰的出现是由于酚基、羟基或羧基的Ｏ-Ｈ振动引起的，２９２５～２８５０ｃｍ^－１范围内的吸收峰依照Ｆｉｌｉｐ等的解析，应归属于脂肪族化合物ＣＨ_３和ＣＨ_２的Ｃ-Ｈ伸缩振动，１７２０ｃｍ^－１峰是因羧基、醛和酮的ＣＯ振动所致，羧酸ＣＯＯ－的非对称振动致使１６２０ｃｍ^－１吸收峰振动强烈，１４２５ｃｍ^－１吸收峰与ＣＯＯ－和Ｏ-Ｈ变形的对称振动及酚类Ｃ-Ｏ的振动有关，１２３０ｃｍ^－１附近的峰应归属于芳香基团的Ｃ-ＯＨ振动或芳基醚、酚类的Ｃ-Ｏ-Ｃ振动，１１２２ｃｍ^－１峰由脂族Ｏ-Ｈ的Ｃ-ＯＨ振动所引起的，多糖与类多糖物质Ｃ-Ｏ的存在可引起１０３４ｃｍ^－１峰的出现。不难发现，ＨＡ组分红外谱图中未见１６５０（ａｍｉｄｅＩｂａｎｄ）和１５４０ｃｍ^－１（ａｍｉｄｅＩＩｂａｎｄ）两吸收峰，这表明ＨＡ组分中蛋白质和缩多氨酸含量极微，通常情况下，淋溶强度较大的砂质土壤ＨＡ组分易出现此类状况，而本研究也许是因为湿热灭菌促使土壤ＨＡ组分中可溶性化合物损失所致。

由表３可知，经细菌、放线菌和真菌处理后的土壤ＨＡ分子中２９２０和２８５０ｃｍ－１两吸收峰的振动强度减弱，表明三个处理均有降低土壤ＨＡ组分中脂族含量的作用。肖彦春等研究认为２９２０／１７２０比值为２９２０和２８５０ｃｍ^－１处峰面积之和与１７２０ｃｍ^－１峰面积的比值，其值可用于衡量脂肪族含量的多少，Ｄ处理ＨＡ组分的２９２０／１７２０比值最大，且高于空白，而其他三个处理２９２０／１７２０的比值均小于空白（大小顺序为Ａ＞Ｂ＞Ｃ），这表明混合菌培养土壤ＨＡ组分的脂族性变强，而细菌、放线菌和真菌均有利于ＨＡ组分的脂族性变弱，其中真菌处理ＨＡ组分的脂族结构含量最少，即真菌对ＨＡ组分中脂族结构的消耗作用最大。

比照空白，Ｃ处理１７２０ｃｍ^－１吸收峰振动略有增加，而１６２０ｃｍ^－１吸收峰强度略有减少，表明羧基类官能团数量增多，即真菌可有效增加土壤ＨＡ组分的羧基含量，而细菌作用恰好相反。与空白相比，所有微生物处理１０３４ｃｍ^－１吸收峰的振动频率均有不同程度降低，可推断，经微生物处理后的土壤，其ＨＡ组分中多糖含量均略有降低，这表明微生物可消耗和利用ＨＡ组分中的多糖类物质，其中混合菌对多糖类物质消耗量最大，Ｆｉｌｉｐ等研究发现，以森林土壤ＨＡ组分作为唯一碳源，经真菌培养后，代表多聚糖的１０３３ｃｍ－１峰几乎完全消失，这与本研究有相似之处。GonzalezPerez等认为ＨＡ组分中多糖含量越多表明该土壤有机质组成越接近植物残体，也就是说，微生物的存在可有效促使植物残体类腐殖质向成熟土壤腐殖质转化。

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2013/8/28 10:08:33 Last edit by 012304

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2013/8/28 9:56:31 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

３结论

经微生物培养的混有麦秸的土壤样品，其ＷＳＳ的红外谱图在指纹区差异较大，表明微生物对ＷＳＳ的结构和官能团数量的影响较大，氨基化合物和芳基醚可被微生物迅速降解，ＷＳＳ的羟基含量可被微生物有效减少，其中，真菌对羟基的消耗最小，而放线菌对其消耗最大。经细菌培养，土壤ＷＳＳ含有较多脂肪族烷烃类物质，而该类物质经放线菌、真菌和混合菌处理后均有减少趋势，减少幅度最大的为混合菌

处理。放线菌对ＷＳＳ中酚类物质的消耗最大，而真菌对其消耗最小。接种微生物有利于提高土壤ＷＳＳ中羧基的数量，其中细菌和放线菌的作用较大。微生物在培养过程中可消耗ＷＳＳ中几乎全部的多聚糖，尤其是混合菌处理。

放线菌在减少土壤ＦＡ组分中羟基含量的能力最强，其次为真菌，放线菌最弱。ＷＳＳ合成或ＨＡ分解所形成的ＦＡ分子可掩饰原有ＦＡ分子的分解，其中，真菌对土壤ＦＡ的“净生成”能力最强。脱聚合作用发生在真菌处理土壤的ＦＡ中。经真菌培养后的土壤ＦＡ中羧基含量增幅最大，其次为放线菌，混合菌最少，但仍高于空白。另外，真菌有利于提高ＦＡ分子中碳水化合物的数量，其次为混合菌，细菌处理最小。除混合菌外，细菌、放线菌和真菌均有利于土壤ＦＡ中多糖的降解和脂类的分解。

在ＨＡ方面，湿热灭菌易导致其缺失１６５０和１５４０ｃｍ^－１两处吸收峰。细菌、放线菌和真菌均有利于降低土壤ＨＡ中脂族的数量，其中真菌处理ＨＡ的脂族结构含量最少，而经混合菌培养后的土壤ＨＡ脂族性变强。此外，真菌可有效促使土壤中ＨＡ羧基含量的增加，而细菌作用相反。供试微生物可消耗和利用ＨＡ中的多糖类物质，其中混合菌的消耗量最大。微生物的存在可有效促使植物残体类腐殖质向土壤成熟腐殖质转化。

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