RTCA技术在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用 微生物和病毒通过感染宿主细胞改变宿主细胞的生理功能,进而导致了疾病的发生。对病原体感染细胞的分析除了作为一个重要的感染诊断结果,还可以为我们提供关于微生物-宿主和病毒-宿主之间相互作用功能性评估的重要信息。迄今为止,虽然已经开发了多种基于细胞分析的微生物和病毒感染诊断方法,但却几乎没有一个平台的技术是专门用于此目的的。而且大多数分析方法的结果是定性的而无法定量,并且诊断的敏感性和准确性还有待提高。因此,我们迫切需要一种定量的、多功能的、快速的、且易于使用的细胞分析系统,而艾森生物研发的实时细胞分析技术正是集这些特点于一体的新型细胞分析技术。下文我们将介绍该技术在微生物和病毒感染中的应用,包括细胞毒素检测、细菌与宿主细胞之间相互作用检测、病毒介导的CPE定量分析、中和抗体检测、寄生虫感染活动的评估和免疫系统功能检测。
应用实例一:RTCA实时动态检测病毒Cytopathic Effect效应
病毒引起的细胞病变作用Cytopathic Effect(CPE)是评价病毒的感染力及致病效应的通用方法。目前研究病毒的最常用方法是空斑实验。空斑实验的结果是来自于终点法检测,因此无法获取病毒复制及其引起的细胞病变的完整信息,此外,空斑实验过程中人工操作步骤过多,增加了操作人员感染病毒的风险。RTCA实时细胞分析技术可用于细胞增殖检测、细胞黏附及细胞活性检测等。因此,RTCA实时细胞分析技术的应用领域非常广泛,涉及新药研发、毒理学、肿瘤学、医学微生物学及病毒学等。同时该方法还可应用于细胞增殖及细胞毒性检测、细胞黏附和伸展、细胞质控、酪氨酸激酶受体反应、肥大细胞活化及G蛋白偶联受体激活等实验中。
本应用案例讲述了通过RTCA实时细胞分析技术研究病毒介导的CPE效应的实验方法。此方法克服了传统终点法的限制,无需标记,步骤简单,且实时记录病毒CPE效应,成为研究病毒CPE效应的一种简便有效的方法。
本实验使用实时细胞分析技术进行细胞增殖检测,并由此确定滴加病毒的最佳时间点,从结果中可以发现Vero E6细胞的最佳感染时期为细胞接种后20.5h,HEK293则在细胞接种后68.5h(图9A,B),在这个时间点接种密度为50000个/孔的细胞处于平台初期,接种密度为12500个/孔的细胞处于对数生长期。选择这两个时间点可分别观察病毒对增殖平台期和对数生长期细胞的不同影响。
图9. 动力学监测细胞增殖情况。细胞接种于E-Plate 96孔板后置于RTCA实时无标记细胞功能分析仪实时动态监测细胞增殖状况,并确定加入病毒的时间(细胞生长对数期或平台期)。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每30min检测一次(A)Vero E6细胞及(B)HEK293细胞黏附伸展及增殖状况。不同颜色的曲线代表不同的细胞接种密度。
通过RTCA实时细胞分析技术实时动态检测细胞状况,发现Vero E6细胞无论在增殖平台期还是在对数生长期用高低两个滴度的病毒处理细胞都能产生CPE效应。当Vero E6在对数生长期感染病毒,病毒的CPE效应与病毒接种的滴度呈明显的相关性(图10)。在VSV病毒以较低的滴度(80,000 PFU)感染细胞,在感染期的15h Vero E6细胞的生长状况(图10A,蓝色曲线)与对照组类似(图10A,绿色曲线),但之后VSV病毒开始复制并诱导了细胞的死亡,表现为CI值下降,24h后CI值下降到50%(CI50),并持续下降,最后降为0,细胞全部死亡。若VSV病毒以较高的滴度(800,000 PFU)感染细胞,CI值在感染后4h就有所下降,在感染后11h下降到CI50。
VSV病毒在Vero E6细胞生长平台期感染与细胞生长对数期感染的结果类似(图10B):VSV病毒以较高的滴度(800,000 PFU)感染细胞,10h后CI值下降到CI50(图10B,红色曲线),VSV病毒以低滴度(80,000 PFU)感染细胞,19h后CI值下降到CI50(图10B,蓝色曲线),最后CI值也下降为0,细胞尽数死亡。
图10. 实时监控VSV病毒感染后Vero E6细胞的生长状况。(A)对数生长期细胞标准化CI值;(B)平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对Veri E6细胞黏附伸展及增殖的影响。
根据实时细胞分析技术检测到的细胞增殖曲线,选择HEK293细胞接种后68.5h滴入病毒(图11A,B)。感染VSV病毒后HEK293细胞与Vero E6细胞的反应不一致。HEK293在细胞对数生长期对病毒的作用非常敏感:高滴度的VSV病毒作用细胞后细胞CI值下降到CI50只要6h(图11A,红色曲线);低滴度病毒组细胞CI值下降到CI50也只要12h(图11A,蓝色曲线)。然而,VSV病毒在细胞生长的平台期感染细胞的结果却完全不同(图11B)。高滴度病毒在细胞增长平台期感染细胞CI值变化的趋势和细胞对数生长期感染细胞的结果一致(图11B,红色曲线);而低滴度病毒接种于平台期细胞时,细胞CI值变化趋势却与对照组相似,说明低滴度病毒对平台期HEK293没有产生CPE效应(图11B,蓝色和绿色曲线)。
图11. 实时监控VSV病毒感染HEK293细胞的生长状况。(A)对数生长期细胞标准化CI值;(B)平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对HEK293细胞黏附伸展及扩增的影响。
Vero E6与HEK293唯一的不同之处在于HEK293能产生Ⅰ型干扰素,Vero E6敲除了Ⅰ型干扰素基因,Ⅰ型干扰素基因可以上调抗病毒活性蛋白如MxA及OAS/RNaseL蛋白的表达,这就导致了两种细胞对VSV病毒的不同响应。HEK293细胞有完全的干扰素系统,当病毒感染时,HEK293细胞能产生干扰素并激活JAK/STAT信号通路,并引起抗病毒活性蛋白表达量的增加,细胞的抗病毒能力随之增强。因此,推测本实验中干扰素系统的作用是HEK293细胞对低滴度病毒(PFU 80,000)产生抗体的关键因素。细胞对VSV病毒的不同响应有助于研究细胞的抗病毒作用机制。
综上所述,与常规终点法相比,RTCA实时细胞分析技术可以实时动态监控病毒与宿主细胞相互作用,且无需标记,为科学研究带来了极大的便利。
应用实例二:RTCA实时定量检测病毒侵染效力及评估中和抗体效价
本研究中,以H1N1病毒为例,着重介绍RTCA实时细胞分析技术在病毒学检测中的应用。我们应用实时细胞分析技术实时监测MDCK细胞中的H1N1病毒引起的细胞病变效应,并进行定量分析。同时,用该法评估了21个接种H1N1流感疫苗的健康个体在接种前和接种后的中和抗体效力,并与传统凝血实验得到的数据进行对比。
为确定合适的MDCK细胞接种数量,向E-Plate检测板接种不同数量的细胞,利用RTCA技术进行细胞增殖检测。根据细胞增殖曲线,确定1×104/孔为最佳接种量。根据不同剂量TPCK-胰蛋白酶作用下病毒对MDCK细胞的侵染情况,确定最佳的胰蛋白酶浓度为2.5ug/ml,此浓度对MDCK细胞增殖的影响最小。
MDCK细胞到达对数生长期时,向其中分别加入5.5×108/ml的SH37T的SH143T病毒株,RTCA实时动态监测病毒介导的CPE,同时显微镜下观察细胞CPE状态(图12A)。随着H1N1病毒的大量复制,导致细胞逐渐死亡,RTCA检测显示细胞指数(CI)下降(图12B),而对照组未感染细胞呈正常增殖状态。平行进行的WST-1实验进一步证实了细胞指数(CI)变化可反映H1N1病毒介导的CPE(图12C),在WST-1实验中,细胞感染病毒后,活细胞量减少,引起吸光值明显下降,该结果与RTCA检测获得的结果是完全相同的。上述试验表明RTCA实时细胞分析技术可实时动态和准确的检测H1N1病毒感染引起的CPE。当测试感染病毒数下降一个梯度时,CPE起始时间延迟约8h,说明病毒负荷量与CPE之间有直接的相关性。
图12. RTCA实时动态检测H1N1病毒引起的细胞CPE。(A)显微镜下检测MDCK细胞被SH37T病毒株(1:10稀释)感染24h,48h,72h后的反应情况。(B)RTCA实时动态检测SH37T病毒株感染MDCK细胞引起的效应。箭头指示在该时间点加入不同稀释梯度的病毒。(C)比色法检测SH37T病毒株(1:10稀释)感染MDCK细胞引起的细胞CPE,A450波长处测量病毒感染24h,48h,72h后的OD值。(D)比较两类病毒株SH37T和SH143T在相同数量下的侵染情况,红色标注线代表两类毒株感染细胞引起的细胞指数CI降到0时所需要的时间。
表3. 两类病毒株的TCID50,病毒载量及每TCID50单位的病毒载量。
另外,在病毒载量相同的情况下,病毒株不同,所引起的细胞CPE起效时间及细胞完全死亡时间也不同。例如,在病毒载量为10-1稀释浓度时,毒株SH37T感染引起的细胞全部死亡发生在37h,而毒株SH143T感染引起的细胞全部死亡发生在48h(图12D)。使用比色法TCID50检测,结果显示每TCID50单位SH37T病毒载量小于SH143T(表3),这与RTCA获得的结果一致。上述结果表明,RTCA检测不仅可以量化H1N1病毒引起的CPE,也可检测不同菌株的感染效力。
由于RTCA实时细胞分析技术不仅能够对甲型H1N1流感引起的CPE进行准确的量化,也能定量分析血清中和抗体对CPE效应的阻断或延迟作用。本实验中,我们利用实时细胞分析技术对21个血清样本的免疫效价进行了检测。首先,将MDCK细胞接种于E-Plate检测板上,加入经SH37T病毒预处理的血清,血清稀释浓度分别选择为S0 1:40,S1 1:80,S2 1:160,每组设三个复孔,若血清浓度高于此浓度,病毒复制会被完全抑制。每组加入100 TCID50 单位的病毒载量,RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE,结果见图13。经S0血清处理的细胞指数很快下降为0,其作用曲线接近病毒对照组,表明S0血清稀释浓度高于20倍以上时无法抑制病毒复制。而对于S1和S2,直至血清浓度分别稀释到320倍和1280倍时才观察到细胞死亡,细胞增殖曲线接近细胞阴性对照组(图13B,C)。结果显示S1和S2中和抗体滴度分别为160和640。
图13. RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE。
本实验中,对21对H1N1疫苗接种前和接种后的血清样本进行检测,RTCA中和试验(NT)和传统检测方法试验(HI)同时进行。结果显示两种检测方法的抗体滴度结果的数据都呈现出明显的统计学差异(p<0.05,威氏符号秩序检验)。且两种方法结果具有良好的相关性(Spearman相关系数,r=0.78,p<0.01)。另外,在接种后21天抗体对疫苗的免疫应答达到最大反应时计算抗体滴度值。两种检测方法无明显差异(p>0.05)。因此,RTCA实时动态NT实验结果与传统的HI实验结果是一致的,说明利用RTCA实时细胞分析技术可以准确的定量检测抗体滴度。