主题：【第六届原创】国标只作参考，具体情况具体方法

国标只作参考，具体情况具体方法

    三聚氰胺事件已过去好几年了，现在市场上抓的还是很紧，这个样品的检测方法也是很成熟、完善了。

    我们现在检测原料乳与乳制品中三聚氰胺的依据方法主要还是国标GB/T22388—2008。然而每个实验室的检测设备、操作人员、实验环境等实验室的具体情况都不完全一样，每个地区、每批次的乳制品的实际情况也不太一样。这样在每次检测过程中都完全采用国标方法检测效果可能就不太理想了。下面就具体介绍下高效液相色谱法检测原料乳以及乳制品中三聚氰胺的含量。

    针对液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等样品，先说下样品前处理。

    国标上是这样说的：

    样品超声提取、再震荡，目的是为了使样品完全溶解，三聚氰胺完全析出。如果碰上粘度大等三聚氰胺难析出的样品时，要以实际情况为主，超声、震荡环节时间适当延长些（需要有一定的判断经验），否则检测出的含量可能会低于实际含量。离心处理是为了使样品中固液分离， 4000r/min是离心速度一般来说是比较低的，选择6000-10000r/min，应该会更好些，尤其是对于一些特别分散的样品更好。离心后取上清液，实际固体残渣里任含有三聚氰胺，上清液经滤纸过滤后一般会多于5ml，直接取5ml过滤液，测试结果应该更准确。

    固相萃取处理实质是尽可能的去除样品中的杂质，而三聚氰胺尽可能不损耗。此处理一般分三步，即萃取柱的活化，样品洗涤和洗脱。活化是为了恢复及提高萃取柱的柱效，洗涤是为了去除样品中的杂质，洗脱是为了收集聚集在萃取柱内的三聚氰胺。这几步处理速度尽量匀尽量慢，流速1ml/min是可以的，但尽量要控制瞬时流速，否则一是杂质去除的不够好，二是样品中三聚氰胺损耗的较多。

    氮吹浓缩样品过程要注意两点，一是氮气流量不要太大，二是出气口距液面不要太近，否则样品可能会被吹飞，以至损耗掉。

    样品正常的谱图：

    样品由于提取不好或前处理中损耗较多谱图：

    由于固相萃取效果不好以至杂质过多谱图：

    样品前处理目的主要三点，一是提取尽可能完全，二是去除杂质尽可能彻底，三是样品中的被测物（三聚氰胺）损耗尽可能的小。在实际工作中操作员的能力、态度和经验是非常重要的，对实验数据的准确度、精密度、回收率是非常有帮助的。

    再说标准曲线的建立。

    现在国标中三聚氰胺检测的定量限为2.0mg/kg，限量为不高于2.5mg/kg。实际如果没有人为添加（包括在饲料、水、设备、原料奶及乳制品等中），三聚氰胺在乳制品中的含量是非常的低的。既然定量限和限量都不高，那么标准曲线中三聚氰胺含量是不是也应该降低些呢。0.8ug/ml按方法中算出来实际上就是2.0mg/kg。我个人觉得标准曲线中的点取0.1、0.5、2.0、5.0、10ug/ml应该更实际更好些。

    下面再说色谱条件和色谱效果。

    C₈色谱柱和C₁₈色谱柱都可以用于检测三聚氰胺，一般来说C₈色谱柱检测效果要比C₁₈色谱柱更好些。流动相的比例那也得看实际情况了，流动相中乙腈含量越高分析时间会越短，但分离度也会越差，乙腈含量越低分析时间就会越长，但分离度会越好。如果三聚氰胺峰附近没有干扰峰，那可以缩短分析时间，如果三聚氰胺峰附近有干扰峰，那得尽量使两个峰分开，尽量适当减少乙腈含量延长分析时间。下面就出两个图比较下。

色谱条件

色谱柱：C8色谱柱，250mm X 4.6mm，5um

流动相：离子对试剂缓冲液：乙腈=85:15（V:V）

流速：1.0ml/min

柱温：40℃

波长：240nm

进样量：20uL

    三聚氰胺标准品色谱图：

    某样品色谱图：

    这样三聚氰胺峰和杂质峰的分离度就不好，结果就不会准确。下面改变下色谱条件中的流动相，离子对试剂缓冲液：乙腈由原来的85:15（V:V）改为90:10。

    改变了色谱条件后效果明显好了很多。

    最后说下目标峰的确定。

有些时候目标峰和杂质峰在保留时间定性时都非常接近，不好确定。比如以上谱图，三聚氰胺和后面的那个峰如果不能准确确定时，可以通过以下方式准确、可靠的确定。先分别算一下每一个可能的峰的含量，我们以下这两个峰的含量“1”为0.13ug/ml，“2”为3.72ug/ml。这样我取一点样品放到一个小一点的容器中（如一毫升甚至更小的容器），加一些大于任何一个峰含量的标准品，下面这个可以加5ug/ml的，也可以加10ug/ml的。结果这两个峰（如果有多个峰，方法仍实用）肯定会有一个因浓度增加而变大，另一个因被稀释而变小，变大的那个就是目标峰，另一个是杂质。

    实验谱图：

    样品加标样后的谱图：

    效果很明显，这样确定目标峰就非常容易了，前面那个就是。需要注意的是样品加标样，它们的体积比例不一样，谱图效果是不一样的，建议它们的比例为1:1或接近1:1。另外实验谱图中的目标峰确定后就可以做定量计算，样品加标样后的谱图只作定性参考，不涉及定量计算。

    分析实验是一个繁琐的工作，尤其是在所做的样品种类非常多的实验室。每一类、每一种、每一个样品的特性可能都不一样，每一个实验室的具体情况（包括实验室条件、操作者情况、实验设备情况等等）可能也不完全一样。所以有些样品的检测就不能完全依靠国标的方法，就要具体情况具体分析了，我们做实验时尽量制定一套更适合于该样品的检测方法。

    以上所说的主要是两个方面：

    1.前处理讲的是样品提取好、损耗小、杂质残留少。该慢的时候就得慢，比如样品提取、固相萃取、浓缩等前处理环节；该快的时候就得快，比如溶解、混合、离心等前处理环节。

    2.样品分析讲的是快、准。也是该快的快该慢的慢。快了节省时间，降低费用；慢了分离度好，结果准确。再一就是准确的确立目标峰，现在用的方法很多，一般有两种，一种是质谱法，一种是加标法；相比加标法更简单、方便，更实用。

    最后再次提醒大家，国标只是参考，不能完全依靠，一定得具体情况具体方法。