主题：【第六届原创】酶标仪的应用-羟自由基清除能力方法

羟自由基清除能力方法研究

1.实验原理
经典的Feton反应是在Fe²⁺催化下H₂O₂释放HO·，而HORAC方法是以Feton反应的基础上改进而来，即以Gallic Acid或Trolox为定量标准，根据自由基破坏荧光探针使荧光强度产生变化的原理，以荧光素钠盐（FL）为荧光物质，过氧化氢在金属离子M诱导下释放羟自由基，将荧光素钠盐氧化，荧光强度变化的大小反映自由基破坏的程度。当抗氧化剂存在时，可与金属离子反应，抑制金属离子与过氧化氢反应，减少羟自由基产生，从而减缓其荧光衰退的速度，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力(图1)。

FL+M+H₂O₂      oxidized FL (loss of fluorescence)

M+ L（antioxidant）      M(L)



图1  HORAC检测示意图

2.实验方法

样品、空白和标准物质(Trolox)各20μL，分别与160μL的荧光素溶液混合均匀，37℃保温10min，然后再加入10μL过氧化氢溶液与10μL金属离子溶液，混匀后迅速利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度值记为f0。迅速开始测定，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f1, f2, f3  …，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的曲线下净面积(net area under the curve, net AUC)。抗氧化剂的HORAC值是通过其荧光衰退曲线的net AUC与标准物质Trolox的net AUC相比得出的。HORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。

3.试剂溶液的制备

3.1磷酸盐缓冲溶液

3.1.1缓冲溶液储备液

0.75 M Na₂HPO₄：268.6 g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1 L ddH₂O；

0.75 M NaH₂PO₄：90 g NaH₂PO₄溶于1 L ddH₂O。

3.1.2缓冲溶液工作液

分别量取Na₂HPO₄贮备液81 mL，NaH₂PO₄贮备液19 mL，混合后用ddH₂O定容至1000 mL，这样得到75 mM，pH 7.4的缓冲溶液，冰箱下贮存。

3.2荧光素钠盐溶液

荧光素钠盐贮备液1：称取0.0456g荧光素钠盐定容到100mL磷酸缓冲液，4℃黑暗贮存；

荧光素钠盐贮备液2：1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存；

荧光素钠盐工作液：800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存。

3.3 Trolox标准溶液的配制

5.00mg  Trolox定容到10mL磷酸盐缓冲液中，得到2mM的贮备液，4℃黑暗贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成10，20，40，60，80，100μM的工作液；相同的方法来配制6.25，12.5，25，50，100μM的Trolox工作液。

3.4 Gallic Acid标准溶液的配制

0.17012g  Gallic Acid定容到100 mL磷酸缓冲液中，得到10mM的贮备液，4℃黑暗贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100，200，400，600，800μM的工作液。

3.5 过氧化氢溶液

30%的过氧化氢溶液（8.8M）用双蒸水稀释至0.53M。

3.6 Fe(Ⅲ)-EDTA溶液

分别称取0.1944g 氯化高铁与0.3570g EDTA二钠盐，定容于100mL双蒸水，得到7.2mM的Fe(Ⅲ)与 9.6mM EDTA的混合溶液。

3.7 CoF2-PA溶液

15.7mg的Co（Ⅱ）四水氟化物和20mg的Picolinic Acid溶于10mL的双蒸水，得到9.2mM的CoF2-PA溶液。

4.数据处理

HORAC的计算方法与ORAC的计算一样，也是通过荧光衰退曲线下面积AUC来计算。

Trolox标准溶液曲线下净面积Net AUC的计算公式是：Net AUC = AUC_Trolox − AUC_blank ，通过以曲线下净面积Net AUC与浓度绘制Trolox的标准曲线，得出标准方程。

样品曲线下净面积Net AUC的计算公式是：Net AUC = AUC_样品 − AUC_blank ，计算样品的曲线下净面积Net AUC，将样品的Net AUC值带入Trolox的标准曲线即得浓度，再换算出最终浓度，即为HORAC值，HORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。

5.方法学研究

5.1 金属离子的选择

金属离子的选择上比较多，有Co(II)、Fe(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)等，之前参照J. Agric. Food Chem., 2002, 50 (10), pp 2772–2777文献中的方法进行HORAC试验，即采用Co(II)-PA/H2O2的反应体系产生HO·，以没食子酸为参照标准物质，经过实验荧光强度衰退缓慢。（见图2）

图2  Co(II)-PA/H2O2荧光强度衰退图

图3  试剂盒荧光强度衰退图

图4  Fe(Ⅲ)-EDTA/H2O2荧光强度衰退图

图5  Trolox标准溶液荧光衰退曲线图

图6  Trolox标准溶液线性拟合

图7  Trolox标准溶液二次多项式拟合

图8  Trolox标准溶液点对点拟合

表1 三种拟合方式的测定值与实际值偏差

表2 精密度与准确度试验

表3 回收率试验

④比较ORAC与HORAC，HORAC主要是分析金属螯合自由基的预防能力，而ORAC是针对过氧化物自由基，两者之间是针对不同的自由基，因此不具备有良好的相关性。

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