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主题：【讨论】ELISA试剂盒基础知识问答

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hysw

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发表于：2013/11/15 14:28:26 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

问：在ELISA试剂盒实验前我们需要的基本试剂有哪些？
答：捕获抗体
检测抗体
链霉亲和素-HRP
标准品
96孔酶标板：选择具有中等或高吸附力的酶标板，禁止使用培养板
包被溶液：0.1M的PBS或者TBS，PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液
阻断溶液：含3％BSA的TTBS或PBS，或者含有3-5%血清的PBS
标准品/标本稀释液：含1％BSA的TTBS或PBS
洗液：含0.02％吐温20的0.002M咪唑盐溶液或者PH7.4的PBS溶液
底物溶液：两组份或者一组份的TMB显色液
终止液：2N的硫酸或者1％HCl溶液
封板膜
问：elisa试剂盒血清标本采集需要注意什么呢？
答：1) 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。
2) 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
3) 血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。
4) 冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。
5) 标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
问：测抗体可以用什么方法，有操作步骤么，谢谢。
答：捕获法测IgM抗体
　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
问：血清的类别有哪些还有要怎么鉴别呢？
答：血清的类别：
胎牛血清、透析型胎牛血清、天然低IGG胎牛血清、干细胞培养胎牛血清、特殊用途胎牛血清、活性炭/葡萄糖处理胎牛血清、胎牛血清替代物、小牛血清、新生牛血清、加强型小牛血清、补铁小牛血清、成牛血清、供体马血清、兔血清、鸡血清、猪血清、马血清、其他动物血清、合成血清替代品
鉴别方法：
血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。

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2013/11/19 18:50:04 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

此类试剂盒确实存在很多优点

一、高效、灵敏、特异的抗体；
　　二、稳定的重复性和可靠性；
　　三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；
　　四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；
　　五、节省实验经费。

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2013/11/20 11:29:15 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 平凡人(zhaoyt1979) 发表:
此类试剂盒确实存在很多优点

一、高效、灵敏、特异的抗体；
　　二、稳定的重复性和可靠性；
　　三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；
　　四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；

　　五、节省实验经费。

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