摘要：采用高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定动物组织中青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林、苯唑青霉素、萘夫西林、双氯西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑林等10种β-内酰胺类抗生素残留量，以青霉素G-D7为内标。β-内酰胺类抗生素残留物用乙腈水溶液提取，用艾杰尔PEP-2固相萃取小柱净化，采用高效液相色谱-串联质谱测定，使用内标法定量。本方法采用5ug/kg、10ug/kg、25ug/kg，3个添加浓度，每个浓度添加6个平行样，上述10种β-内酰胺类抗生素的回收率在平均在70%-110%，相对偏差小于10%。

关键词：液相色谱串联质谱法；β-内酰胺类药物；动物组织

β-内酰胺类抗生素(β-lactams)是指化学结构中具有β-内酰胺环的一类抗生素.其侧链的改变形成了许多不同抗菌谱和抗菌作用的抗生素，包括临床常用的青霉素与头孢菌素^[1,2]。此类药物广泛用于产肉动物的呼吸、肠胃、泌尿生殖和皮肤病毒感染的治疗和预防^[3]，它们的使用会引起动物源性食品中兽药残留的存在，这种残留将对青霉素过敏的人产生健康危害。更为重要的是，抗生素被长期低剂量摄入健康人肠道，会破坏健康人肠道正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，而且长期使用会产生抗药性，危害人们的身体健康^[4]。欧盟、美国、日本、中国、国际食品法典委员会都对动物源食品中β-内酰胺类抗生素药物残留规定了最大残留限量^[5]。为确保消费者的食品安全，世界各地均对动物组织中β-内酰胺类抗生素有允许最大残留量的要求。本研究建立了采用高效液相色谱三重四级杆质谱法对动物组织中10种β-内酰胺类抗生素残留的检测方法，具有更高的回收率、稳定性和实用性。

1. 材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1试剂和材料

乙腈、甲醇：德国默克，色谱纯；甲酸：色谱纯；氯化钠：分析纯；氢氧化钠：分析纯；磷酸二氢钾：分析纯；磷酸氢二钾：分析纯；固相萃取柱：艾杰尔PEP-2（500 mg/6mL）。标准品：购自DR公司。

0.1 mol/L氢氧化钠：称取４ｇ氢氧化钠，并用水稀释至1000ｍＬ。0.05mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH 8.5）。称取8.7 g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至1000ｍＬ，调节pH 至8.5±0.1。

标准储备溶液：分别称取约0.01 ｇ（精确至0.001 ｇ）标准品，分别用乙腈:水溶液（1+9）溶解定容至100 ｍＬ，此标准溶液浓度为约为100 ug/mL，置于-18℃冰箱避光保存。

1.1.2仪器和设备

高效液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）：AB5500；电子天平（奥豪斯）；旋转蒸发器（东京理化）；离心机（贝克曼）；均质器（IKAT18）；旋涡混合器（德国IKA）；pH计(梅特勒)。

1.2测定步骤

1.2.1　提取

称取样品2.01 ｇ（精确至0.01 ｇ）于50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈水溶液（9+1，体积比），涡旋混匀后在4000 ｒ／min下离心5 min，将上清液转移至另250 mL 鸡心瓶中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加入10 mL乙腈水溶液（9+1，体积比），旋涡混合后，在4000 r/min下离心5 min，合并上清液，向鸡心瓶中加入4 mL饱和氯化钠溶液，防止旋蒸过程中样品起泡沫。将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37 ℃水浴）蒸发除去乙腈。

1.2.2净化

向鸡心瓶中加入20 mL0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH8.5），涡旋混匀1 min，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5。将固相萃取小柱安装在固相萃取装置上，用前用5 mL甲醇，5 mL水，5 mL0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH8.5）预处理，将提取液以1 mL/min的流速上样。用5 mL0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH8.5）淋洗，再用5 mL超纯水淋洗。抽干后用6 mL乙腈洗脱（速度控制在1 mL/min），洗脱液收集于10 mL玻璃试管中。将洗脱液于４５℃下氮气吹干，用乙腈水溶液（1+9）定容至1 mL。过0.22 um滤膜后，用液相色谱串联质谱测定。

1.3色谱-质谱条件

色谱柱：C18柱，100*2.1 mm，5 um（菲罗门）；流速：0.3 mL/min，流动相乙腈和1‰甲酸水梯度洗脱（见表1）

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测。气帘气30；GS1/GS245/55；喷雾电压5500V；碰撞能量等参数应调节使质谱灵敏度达到最佳。

2. 结果与讨论

2.1质谱条件的优化

用ESI+离子扫描，根据化合物的性质确定喷雾电压、气流、碰撞能量等参数，使灵敏度达到最佳。（参数见表2）

2.2线性方程

配置浓度为0,5,10,20,30,40,50ug/kg的混合标准曲线，分别以选定的定量离子峰面积与内标物的峰面积比值与浓度绘制标准曲线，在0-50ug/kg的范围内呈线性，相关系数R²均大于0.99（见表3）

2.3回收率实验

取同一批阴性样品加入5ug/kg，10ug/kg，25ug/kg三个浓度的混合标准品，每个浓度做6个平行，求其平均值和相对标准偏差（见表4）

3. 结论

本实验通过对样品处理、净化以及仪器条件的优化等处理，建立了内标法测定动物组织中10种β-内酰胺类抗生素残留的检测方法，回收率稳定，其准确率和精密度均能满足有关法规的要求。

参考文献：

[1] 仉文升、李安良。药物化学[M]。北京：高等教育出版社，1999.571

[2] 刘文英。药物分析[M]。北京：人民卫生出版社，2000 233.

[3] Granelli K, Christina Elgerud,Asa Lundstrom, et al. Rapid multi-residue analysis of antibiotics in muscle by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 637:87-91.

[4] 袁萍、刘亚风、祝伟霞等动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测研究进展。 2010年第3期Vol 20 No.3 65-68

[5] Federica Bruno, Roberta Curini, Antonio Di Corcia, et al. Sosid-phase extraction followed by liquid chromatography mass spectrometry for trace determination of β-lactam antibiotics in bovine milk[J]. J Agric Food Chem, 2001,49:3463-3470.

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