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主题：【求助】运行磷酸盐梯度高浓度时候基线漂移

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啥都不懂1982
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发表于：2014/08/14 17:41:49 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
最近在分析三磷酸脱氧核苷(dCTP, dTTP, dATP, dGTP)。用的是强阴离子交换色谱，紫外检测器(DAD)，磷酸盐缓冲液，安捷伦1200系统。色谱柱用的是SAX柱子， 125*4.6 mm, 5um 填料。紫外波长260 nm. 以前实验室就是用 0.35 M 的磷酸二氢钾做等度洗脱，所以基线很平稳。但是因为有两个化合物保留时间太长，峰很宽，所以想改用磷酸盐浓度梯度洗脱。可是当我做0.1 M 到 0.5 M的梯度时， 基线吸收变高很多，以至最后出来的两个峰在上升的基线上了(图传不上来，一会儿再试试)。如果运行pH梯度，我的这款色谱柱需要很长的平衡时间。我买了Sigma 的 分析纯和HPLC纯度的磷酸盐；也在Thermo买了HPLC纯度的，但是情况都差不多。Bio-rad有净化磷酸盐的材料，但是用起来很麻烦，而且还不知道真的用起来效果如何。

想在此求助高手们如何解决磷酸盐高浓度基线漂移问题的？或者有没有更好的用紫外检测器分析这些三磷酸形式核苷的方法 （质谱除外，条件不允许啊）？听说有的紫外检测器是可以补偿基线漂移的，不知道这安捷伦的检测器是否有这个功能？在设立紫外参数的时候，在检测波长的后面有一个参照波长，这个是否对检测有什么帮助和影响。

先谢谢大家的热心帮助了！

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2014/8/15 9:00:15 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
个人感觉，你可以加大盐浓度，你主峰出在10分钟以后，为什么不加大盐浓度呢？
跑梯度基线不可能平的吧，安捷伦可以设置参比波长，一般是360NM，可以根据化合物自己设置，是化合物没吸收的地方选波长，用来补偿仪器和温度影响的，你可以试试。但是你选260这样的波长，效果不是很大.....
该帖子作者被版主 bingwang228加 2积分， 2经验，加分理由：应助
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e_liang369
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2014/8/15 9:08:19 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
正常现象吧
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bingwang228
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2014/8/15 9:19:43 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
走梯度时基线漂移是常见的现象。同2楼意见，你的第一个峰出峰时间较晚，前面无干扰组分，建议适当增加初始流动相的浓度，后面的梯度让浓度变化再平缓一些
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啥都不懂1982
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2014/8/15 17:18:15 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zhonghuaying1(zhonghuaying1) 发表:
个人感觉，你可以加大盐浓度，你主峰出在10分钟以后，为什么不加大盐浓度呢？

跑梯度基线不可能平的吧，安捷伦可以设置参比波长，一般是360NM，可以根据化合物自己设置，是化合物没吸收的地方选波长，用来补偿仪器和温度影响的，你可以试试。但是你选260这样的波长，效果不是很大.....


谢谢啦！不好意思，没有表达清楚。我上传的图是标准品的图。正常是做生物样品的，前面的十分钟是留给杂质峰的（即使我已经用了固相萃取净化样品了）。而且加大盐浓度的话，第一个和第二峰的分离有些不理想。我现在能想到的办法就是让浓度梯度变化小一些，也许可以配合一点点pH梯度吧。Bio-rad公司的Chelex 100说是可以净化磷酸盐，也不知道效果怎么样。紫外基线上飘应该是因为响应变大了，会是因为磷酸二氢钾在260nm有吸收？还是它其中的杂质有吸收？没研究过啊。
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啥都不懂1982
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2014/8/15 17:19:38 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 bingwang228(bingwang228) 发表:

走梯度时基线漂移是常见的现象。同2楼意见，你的第一个峰出峰时间较晚，前面无干扰组分，建议适当增加初始流动相的浓度，后面的梯度让浓度变化再平缓一些


谢谢应助！我这个是标准品图。正常的真实样品前面挺复杂的。
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zhonghuaying1
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2014/8/15 17:48:54 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你这个条件下的空白是什么样子的？能和标样的基线完全吻合吗？

对于这种色谱纯的磷酸盐试剂来说，并不是紫外吸收的原因，而且纯化不解决问题

就比方我们跑纯水和纯乙腈梯度，基线还是会抬升，不管你用多少的紫外波长，只是不同波长抬升的幅度不一样，

顺便，我只是有个想法，这种基线是不是在某一些或者某一个厂家的离子交换的色谱柱上得到改善或者避免这种问题。
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啥都不懂1982
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2014/8/15 19:08:33 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zhonghuaying1(zhonghuaying1) 发表:
你这个条件下的空白是什么样子的？能和标样的基线完全吻合吗？

对于这种色谱纯的磷酸盐试剂来说，并不是紫外吸收的原因，而且纯化不解决问题

就比方我们跑纯水和纯乙腈梯度，基线还是会抬升，不管你用多少的紫外波长，只是不同波长抬升的幅度不一样，

顺便，我只是有个想法，这种基线是不是在某一些或者某一个厂家的离子交换的色谱柱上得到改善或者避免这种问题。


谢谢！

空白和真实样品几乎是完全吻合的。看样子这磷酸盐的基线漂移还真是挺难解决的啊。我手头上有两根SAX柱子，跑出来情况都差不多。得想点其它方法了。
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bingwang228
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2014/8/15 22:05:24 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 啥都不懂1982(v2799469) 发表:
原文由 bingwang228(bingwang228) 发表:

走梯度时基线漂移是常见的现象。同2楼意见，你的第一个峰出峰时间较晚，前面无干扰组分，建议适当增加初始流动相的浓度，后面的梯度让浓度变化再平缓一些


谢谢应助！我这个是标准品图。正常的真实样品前面挺复杂的。
纯化作用可能真不是很大。可以将等度时的标准谱图和样品图上传，色谱条件更需要考虑样品的分离
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安之若素的我
Ins_09b71444
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2019/1/10 10:24:49 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
大佬用的是dNTP的标准品吗？请问哪里可以购买到啊？
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