主题：【第七届原创】【许愿原创】高效液相色谱法快速测定食用油中5种黄曲霉毒素

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发表于：2014/10/29 15:53:47 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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前言

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种常见的腐生真菌。发霉的花生、花生油、玉米、大米、棉籽等粮食及粮食制品中容易受到黄曲霉素的污染，其主要存在形式为B₁、B₂、G₁、G₂以及另外的两种代谢产物M₁、M₂。在污染的食品中以黄曲霉毒素B₁最为常见，其毒性和致癌性也是最强。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一级致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（主要包括2475荧光检测器，柱温箱，自动进样器）；光化学衍生器；超声波清洗机；微型漩涡混合仪。

1.2 试剂

实验中甲醇和乙腈均为色谱纯；

水为超纯水系统制得；

多功能净化柱（MFC）：Mycosep 228 AflaPat (美国Romer Labs)；

黄曲霉毒素B₁、M₁标准溶液，浓度分别为3μg/mL和10μg/mL，美国O2Si smart solutions，

黄曲霉毒素B₂、G₂、G₁标准溶液，浓度均为2μg/mL，农业部环境保护科研监测所研制

1.3 仪器分析条件

色谱柱：Odyssil C18(250mm×4.6mm, 5μm)；

Cat：OS952505-0

S/N:O9510525BXP0042

流动相：甲醇：乙腈：水=20：25：55；流速：0.8mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；荧光检测器：激发波长355nm，发射波长430nm。

1.4 标准溶液的配制

分别吸取一定体积的黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂和M₁标准溶液，用甲醇配制成浓度分别为300ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的标准储备液。临用前，再吸取一定体积的上述标准储备液，配成相应浓度的混合标准溶液。

1.5 样品前处理

（1）称取5.0g食用油样品于50mL离心管中，加入25mL乙腈/水溶液（体积比84：16）漩涡混匀，超声30min，再以4000r/min离心10min。

（2）取8mL上层清液至多功能净化柱的玻璃试管中，用Mycosep 228 AflaPat多功能净化柱对上清液进一步净化。吸取1mL通过多功能净化柱的净化液，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

Mycosep 228 AflaPat多功能净化柱使用示意图

2、结果与讨论

2.1 色谱条件优化

由于规格型号、填料性质之间的差异，采用不同的色谱柱分离时，需要对色谱条件进行适当的优化，尤其在分离多组分化合物时，调节流动相种类、pH值和流动相中有机相比例能改善色谱峰的保留时间和组分间的分离度。由于本次实验中所用的色谱柱是新购色谱柱，因此需要对色谱条件进行适当优化。首先采用之前色谱柱的色谱条件（甲醇：水=40:60）进行分离，结果5种黄曲霉毒素需要45min才能检测完成，如果样品中有干扰物质，还需要更长的分析时间，因此不符合高效的原则，同时，黄曲霉毒素M₁和G₂的分离度较低，未达到基线分离，提高流动相中甲醇含量虽然可能缩短分离时间，但是会降低这两种组分的分离度，于是往流动相中增加乙腈。当流动相中乙腈含量为20%时，5种黄曲霉毒素达到基线分离，同时分离时间缩短至30min左右，取得一定效果后继续加大流动相中乙腈的含量，同时加大流动相中有机相的比例，当流动相中乙腈含量为25%，有机相比例为45%时，分离时间缩短至20min内，且5种组分的分离度也满足要求。继续增加乙腈含量，当流动相中乙腈含量为35%时，虽然进一步缩短了5种组分的检测时间，但是黄曲霉毒素G₁和B₂却发生了重叠。通过上述色谱条件的优化，结合实际样品的分析，采用甲醇：乙腈：水=20：25：55时的色谱条件进行测定。

2.2 标准曲线

吸取适量体积黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁ 、G₂和M₁的标准储备溶液，用甲醇稀释配成相应浓度的混合标准溶液，并按选定的色谱条件进行分析。结果表明，黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁ 、G₂和M₁的质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系，其相关系数在0.9991~0.9997之间。

2.3 光化学衍生

高效液相色谱法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法，但是黄曲霉B₁和G₁的荧光强度较弱，在水溶液中会发生荧光淬灭的现象，因此需要采用衍生的方法增强B₁和G₁的荧光强度。常用的衍生方法有：柱前三氟醋酸衍生、柱后碘衍生等，但衍生过程复杂、检测灵敏度及重现性受人为因素影响较大。

本实验采用光化学衍生技术，利用紫外光照射，使流动相光解出具有荧光特性的基团，并与黄曲霉B₁、G₁反应，生成荧光特性更强、更稳定的物质，解决了黄曲霉毒素B₁、G₁在水溶液中有荧光淬灭的现象。光化学衍生的原理是利用环状化合物在紫外光照射下能产生荧光这一特性。黄曲霉毒素是结构相似的一组化合物，均为二呋喃香豆素的衍生物，具有芳香环并带有给电子取代基，在芳香烃上导入给电子基团-OH会增强荧光强度。采用光化学衍生可以使流动相中的水，与黄曲霉B₁作用，生成荧光特性更强、更稳定的化合物 (Aflatoxin 2a)，反应示意图见图，黄曲霉B₁、G₁的反应机理相同。

下图为光化学衍生器打开前后测定5种黄曲霉毒素的色谱图，对比两张色谱图可以发现，光化学衍生器打开前黄曲霉毒素G₁、B₁的色谱峰较小，响应值较低；打开光化学衍生器后，经过紫外光的照射，黄曲霉毒素G₁、B₁的荧光性能明显增强，响应值变大。光化学衍生器打开前后黄曲霉毒素M₁、G₂、 B₂并无变化，表明光化学衍生对这3种黄曲霉毒素无影响。

2.4 样品提取与净化

样品的提取方法主要根据其物理化学性质来确定。黄曲霉毒素易溶于极性溶剂而不溶于非极性溶剂，且在中性溶液中较稳定，一般使用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿或几种有机溶剂的混合液对黄曲霉毒素进行提取。黄曲霉毒素虽然难溶于水，但是提取液中少量的水可以润湿基质，增强有机溶剂在样品中的渗透能力，因此，采用有机溶剂与水的混合溶液作为提取剂，可以提高样品的提取效率。本文采用Mycosep 228 AflaPat多功能净化柱说明书要求采用乙腈/水溶液（体积比84：16）进行提取。

多功能净化柱是一种特殊的固相萃取柱，其填料中含有亲脂性（非极性）和电荷活性（极性）成分，可选择性吸附样品提取液中的脂类、蛋白质类化合物和碳水化合物等干扰物质，而让待测化合物通过净化柱，从而达到分离纯化的目的。采用美国Romer Labs公司的Mycosep 228 AflaPat多功能净化柱，对样品中的黄曲霉毒素进行分离纯化，实验结果表明，采用该方法处理后的食用油样品较干净，Mycosep 228 AflaPat多功能净化柱能有效去除干扰5种黄曲霉毒素测定的杂质组分。

2.5回收率实验

选取黄曲霉毒素含量低于检出限的空白食用油样品，在样品中分别按最终浓度为1.60ng/mL加入G₁和M₁标准溶液，最终浓度为0.40ng/mL加入B₂和G₂标准溶液,最终浓度为2.40 ng/mL加入B₁标准溶液,并以上述实验方法进行样品处理和测定, 考察实验方法的回收率。结果表明，该方法能够较好的提取食用油中的5种黄曲霉毒素，黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂和M₁的回收率在88.12~95.42之间。

3、小结

采用多功能净化柱处理食用油样品，具有简单、高效、节省有机溶剂等优点；上层清液通过多功能净化柱时需要控制通过的速度，确保净化柱中的填料能够充分吸附试样中的杂质组分；复杂基质样品需要增加前处理步骤，单一使用多功能净化柱可能达不到预期效果。

主要参考文献：

(1)吴燕,朱怡平,汪国权. 多功能柱净化-光化学柱后衍生高效液相色谱测定食品中黄曲霉毒素[J].中国卫生检验杂志，2011，21（8）：1865-1866

(2)李军，于一茫，田苗，王宏伟，卫锋，李莉，王雄。免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素[J]。色谱，2006，6（24）：581-584