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今天看了版友一片枫叶的帖子
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20141214/5571906/,个人想法与其区别较大,在此我仅说说自己的想法和经验,希望大家多提意见,多交流。
建立一个色谱方法应从了解样品特点,确认检测需求入手。了解样品使你清楚方法建立的难点在哪,明确检测需求使你有方法建立的方向性指导,比如建立一个痕量检测的方法紫外检测器通常是不能满足要求的。
首先我也讨论一下波长的选择,如果大家在低波长范围内进行测试,那么确实是波长越低样品信号强度越高的,但是在方法建立中样品的检测波长一般以目的物的最大吸收波长为主要参考值,因为很多物质(如实际样品中的杂质)都会在低波长有紫外吸收,采用低波长检测会对真实样品的测试带来不便。选择目的物的最大吸收波长一定程度上可以减少真样品测试时的干扰,而这些干扰在使用标准品进行早期方法开发的时候是不易察觉的。
对于流动相的优化一般是方法开发的主体,包括是否使用梯度,pH值,所加盐种类和浓度,所选有机相种类,是否需要添加剂,等。核心目的是所建立的方法对目的物和干扰成分有充分的分离,方法稳定可重复,峰型良好,基本上属于系统适应性考察的内容。降低有机相比例是比较简单的增加样品分离度的方法但会造成样品峰的展宽和整体保留时间的延长,应综合运用各可选条件对方法进行优化,理想的分离时间应使目的物的保留时间在三到五倍的死时间范围内。
对于流速的选择我个人认为主要有两个依据:首先是所选色谱柱根据范氏方程估算的最优线性流速,第二是在实际操作中系统的压力。为了保证系统的安全稳定运行可以适当降低流速。但是我并不推荐在压力较低的情况下提高流速而提高分离时间,这样可能造成体系交换不充分而形成色谱峰畸形,过短的分离时间也会使方法的稳定性(尤其是时间稳定性)表现不佳,柱效也会明显降低。
作者一片枫叶认为流速增大样品分离度降低,这个现象在样品保留时间比较短的情况下是比较明显的,而在样品保留时间超过三倍死时间后其影响就比较小了,降低流速对样品分离度的影响就比较小了。关于流速对样品检测灵敏度的影响要区分两种类型的检测器,即质量型检测器和浓度型检测器。类似紫外检测器的浓度型检测器其样品峰高与浓度相关,改变流速对峰高理论上无影响,实际工作中流速过快样品峰高会有微弱降低。对于质量型检测器(蒸发光散射检测器可近似看做质量型检测器)降低流速样品峰信号高度会明显下降。
对于色谱方法的评鉴应以:柱效、分离度、峰型以及稳定性为核心,对于方法确实对样品的检测灵敏度有影响但检测灵敏度的改善更多依靠于检测器的选择,而检测器对于方法的接受程度是比较高的,特定的检测器有其自身要求,如示差检测器、蒸发光散射检测器、质谱等,在选择这些检测器的时候,其方法建立有特殊要求。
关于色谱方法对灵敏度的影响我补充两句:一般同样的样品在不同的溶剂中表现出的响应强度是不同的,另外使用高柱效的短柱代替低柱效的长柱一般会得到更好的样品响应强度