主题:【第七届原创】【流式细胞仪系列之三】谱图解析

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    流式细胞仪测试的结果,在仪器内是标明荧光强度,前向角散射光强度,侧向角散射光强度,或其他参量的电压值或电流值。本特利微生物测定仪的样品经过染色后,被液流系统送到样品室,激光照射染色后的样品溶液后产生荧光,被检测器光电倍增管检测,将光信号转化为电信号,通过数模转换在计算机上存储结果,数据以CSV格式存储在c/data文件夹下。

    一个数字文件,有易于加工处理和分析的优点,但通常缺乏直观性,如能用一组图形来表明各个参量的相互关系,对操作者来说更为直观。本特利流式细胞仪数据的显示为单参数直方图(histogram)和二维点图(dot plot)两种。

    微生物测定仪有三个谱图,见图1



1仪器显示谱图


1、脉冲高度图(pulseheight/intensity

2 脉冲高度图

    脉冲高度图以脉冲高度为横坐标,细胞数量为纵坐标作图。

2、脉冲宽度图(pulsewidth/duration


3 脉冲宽度图

    脉冲高度图以脉冲高度为横坐标,细胞数量为纵坐标作图。

3、二维点图(dot plot

4 二维点图

    单参数直方图的限制是:只能表明一个参数与细胞数量间的关系,不能显示两个独立参数与细胞的关系。当需要研究两个或更多测定量关系时,可采用二维点图的显示方式。

    在图1中,我们可以把二维点图和对应的直方图都画在一起。点图横坐标表示脉冲高度(height,纵坐标表示脉冲宽度(width)。二维点图上每个点代表一个细胞,每个点与横坐标的距离表示该点的脉冲高度,每个点与纵坐标的距离表示该点的脉冲宽度。

    绘制全部细胞群体的脉冲高度图,即图2中的脉冲高度图,同理绘制脉冲宽度图。我们可以由点图得到两个直方图,但由两个直方图无法反演成一个二维点图,这说明一个点图所携带的信息量大于两个直方图所携带的信息量。

    从三个谱图的坐标位置,我们很明显能看出三者之间的关系。

4、软件中的设置及结果显示


5 软件设置积分起始位置

    选择TOOLS-OPTIONS-CALIBRATION,可以看出脉冲高度积分范围设置和脉冲宽度的积分范围设置。

    对于以上三个图而言,最终的结果为脉冲高度的积分面积来表示。所以,其样品的测试结果严重依赖于积分范围,尤其是积分的起始位置。仪器上设置的积分起始位置为0.4

6 典型的样品的脉冲高度图

    从图6可以看出,最终的报告结果严重依赖积分的起始位置,绿色为积分的部分,灰色没有计算在积分范围内。默认设置的起始位置为0.4。如果电压值偏高,整个谱图会向右移动,会将部分杂峰也积分在内,使结果偏高,反之结果将偏低。这也是为什么要严格规定微球的电压值在0.9-1.1之间的原因,通过微球电压值来确定整个仪器的谱图位置。
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