主题：【第八届原创】水产品中MCX孔雀石绿残留检测的固相萃取方法

水产品中MCX孔雀石绿残留检测的固相萃取方法

一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为水产品中孔雀石绿检测的前处理方法，LC-MS/MS作为检测手段。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物
孔雀石绿标准品：孔雀石绿(CAS: 569-64-2)。
三、应用范围
本方法适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿LC-MS/MS检测及确证。
四、参考标准
推荐性国家标准《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》。
五、实验材料
Biocomma Polybase MCX 固相萃取柱 3mL/60mg。
六、实验方法
1、样品提取
称取均质试样5.0g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中，加10mL乙腈，10000r/min匀浆提取30s，加入5g酸性氧化铝，振荡2min，4000r/min离心10min，上清液转移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，3mL硼氢化钾溶液，振摇2min。
另取50mL离心管加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，加入3mL硼氢化钾溶液，用玻璃捣散离心管中的沉淀并搅匀，涡旋混匀器上振荡1min，静置20min，4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。
在离心管中继续加入1.5mL盐酸羟胺溶液，2.5mL对甲苯磺酸溶液，5.0mL乙酸铵缓冲溶液，振荡2min，再加入10mL乙腈，继续振荡2min，4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中，重复上述操作一次。
在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL鸡心瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈，10mL二氯甲烷，振摇2min，把全溶液转移至50mL离心管中，4000r/min离心10min，下层溶液合并至250mL鸡心瓶中，45℃蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。
2、SPE柱净化
(1)活化：向MCX复合柱小柱中加入5mL乙腈.
(2)上样和洗脱：将上述备用液过柱，加入3mL乙腈-乙酸铵(体积比1:1)洗脱。
(3)浓缩定容：收集洗脱液，乙腈定容至3mL，过0.45um滤膜，供液相色谱-质谱分析。
3、LC-MS/MS条件
色谱柱：Venusil ASB C18(2.1×150mm，5μm，100Å);
质谱仪：API 4000
流动相：A: 0.05mM乙酸铵溶液(0.05%甲酸) B:乙腈溶液；(25:75, 体积比)
流速：0.3mL/min
柱温：35℃
进样体积：2ul
离子源：电喷雾(ESI)，正离子模式
检测方式：多反应监测(MRM)

七、实验结果
1、武昌鱼基质10μg/L孔雀石绿加标回收结果：
三个平行测试样的平均回收率均大于80%，平行样间相对标准偏差均小于5%，符合标准要求。（见表3）

2、空白样品中添加孔雀石绿及其代谢物色谱图


本研究是逗点生物利用固相萃取法作为水产品中孔雀石绿检测的前处理方法，以推荐性国家标准《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》为标准制定，适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿LC-MS/MS检测及确证。