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主题：【原创】定量PCR的一些经验分享

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茶小小乖
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发表于：2015/08/06 09:33:06 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
  RT-qPCR，Ct值（有时也称Cp值）关乎整个实验的最终定论。这时问题来了，融解曲线不是单一峰？复孔之间的Ct值重复性不好？Ct值太大或太小？怎么才能做出比较满意的实验结果，我来说说我的经验和教训。
融解曲线主要说明引物的特异性。融解曲线不是单一峰最主要有以下几方面原因：
引物特异性不好；
引物被污染了；
引物冻融次数太多；
引物浓度太高(这时会有一个比较低的引物二聚体峰)。
相应的解决办法：
重新设计引物；
分装引物，避免反复冻融和污染；
稀释引物浓度；
如果溶解曲线不是单一峰，不管Ct值怎么样，这组实验结果都是不可信的。所以，引物决定了整个实验结果。
复孔之间Ct值的重复性主要取决于加样误差。操作熟练了，加样误差小了，复孔之间的Ct值差异就会越来越小。复孔的数量当然越多越好，但是太多了就会浪费试剂（试剂还是有点贵）。一般3-4个复孔就足以说明问题，复孔之间差异最好不超过0.1，因为Ct值和目的RNA是指数关系，看似差的很小，实则是指数倍的差异。所以不能忽视复孔之间一点小小的差异。
Ct值的大小与目的RNA含量有关。Ct值越大说明目的RNA含量越小，反之亦然。Ct值的大小还和定量PCR仪有关，有的定量PCR仪敏感性很好，即使加进去的模板很少，只要循环次数足够多，最终还是能检测出来。有的定量PCR仪敏感性不好，最终的Ct值就不是很好。
总体来说，Ct值范围在15-25之间比较好。但是只要复孔之间Ct值重复性比较好，不管Ct值或大或小，这组数据就可信。

关于定量PCR，先说这么多，以后有别的经验或教训，再给大家分享。
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2015/11/3 16:14:56 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
不错的经验，总结得很好！
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