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主题：【求助】cIEF检测单抗，各峰相对丰度不稳定

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lingyou

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发表于：2016/01/14 09:47:22 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

最近在做一个中性单抗的cIEF方法，用的是贝克曼PA800plus。在对标准品进行分析的时候发现，不同时间检测的结果，各峰的相对丰度会有变化，最高峰有时候是第二个，有时候是第四个。样品、仪器、人员、缓冲体系等条件都是一样的。各峰的pI值也很稳定。这种情况是正常的吗，这样的结果很不利于对各峰制定标准，不知道大家都是怎么做的？
我采用的方法和体系基本都与贝克曼提供的一致，尿素浓度采用6M，聚焦时间是12.5min.对聚焦时间进行过优化，分别考察了10min，12.5min，15min，17.5min和20min，除了10min分离度不好外，其他结果图谱基本一致，考虑到节省时间选了12.5min。最近对结果进行分析的时候，发现各时间的电流图有点差异。聚焦结束时，17.5min电流降到最低大概1.5uA，15min 大概1.6uA，而12.5min大概1.7，1.8uA这样。
是不是我选择的聚焦时间不够导致了相对丰度会有变化？如何判断聚焦时间，是电流降到最低表示聚焦充分吗？
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2016/1/16 11:12:51 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、标准品有没可能发生降解？
2、是否有分子量、性质都很接近的蛋白质？因为这样的蛋白质本来分得就不是很开，条件稍微有变化的时候就显示出数量不同的峰。
3、分离得到的峰个数不同，相对丰度当然会有变化。
4、理论上，应该是聚焦结束的时候电流最小

没做过，纸上谈兵，仅供参考

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2016/1/16 11:13:08 Last edit by nini2006

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2016/1/18 8:03:04 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 nini2006(nini2006) 发表:
1、标准品有没可能发生降解？
2、是否有分子量、性质都很接近的蛋白质？因为这样的蛋白质本来分得就不是很开，条件稍微有变化的时候就显示出数量不同的峰。
3、分离得到的峰个数不同，相对丰度当然会有变化。
4、理论上，应该是聚焦结束的时候电流最小

没做过，纸上谈兵，仅供参考

1.标准品是冻存的，每次新取，降解不太可能
2.标准品比较纯，同时没有做其他物质，应该不可能有干扰
3.峰的个数没有变化，只是峰的高度有差异
4.工程师说理论上聚焦没有结束，谱图合适就行
所以不知道这种现象产生的原因

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