高效液相色谱法测定红茶中着色剂
摘要:建立高效
液相色谱仪测定红茶中日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红的方法。样品经过水-乙醇溶液溶解,经过
固相萃取小柱(月旭Welchrom® PA,1g/6mL;货号WSP050306)中吸附洗脱,所得的洗脱液经C18柱色谱柱(月旭Ultimtae XB-C18, 4.6×250 mm, 5μm;货号:00310-02043,序列号:w13211570)进行分离,流动相为甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液以不同比例进行梯度洗脱,先采用紫外检测器的254nm进行5种同时测定,然后对有日落黄等检出的结果进行最大吸收波长的测定验证。.
关键词:高效
液相色谱仪、红茶、合成色素
检验依据:
GB/T 5009.35-2003食品中合成着色剂的测定 ;
GB/T 21916-2008水果罐头中合成着色剂的测定 高效
液相色谱法;
SN/T 1743-2006食品中诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测 高效
液相色谱法;
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1仪器安捷伦1100高效
液相色谱仪,配紫外检测器;密理博超纯水机;超声波消洗器;固相萃取仪(配固相萃取柱:月旭Welchrom® PA,1g/6mL;货号WSP050306)
1.1.2试剂甲醇、乙酸铵均为色谱级;试验用水为超纯水
柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红标准储备液:10ug/mL
1.2实验条件色谱条件:色谱柱:月旭Ultimtae XB-C18, 4.6×250 mm, 5μm;货号:00310-02043,序列号:w13211570,柱温40℃;流量1mL/min;进样量10uL;检测波长:254nm。流动相:A为甲醇,B为0.02moL乙酸铵溶液。梯度洗脱程序见下表:
1.3试验方法红茶样品经粉碎后备用。称取粉碎均匀试样5.00g于刻度离心管中,加乙醇-氨水-水(80+1+19)溶液10mL,涡旋振荡5min,静置放置一小时后进行再涡旋振荡5min,3000r/min离心10min,干过滤收集滤液,将剩余的残渣重复提取二次,最后洗涤残渣二次,每次约用甲醇水溶液5mL,将收集的全部滤液(约40mL)至于80℃水浴加热浓缩至5mL,为试样溶液待SPE净化。
1)活化:5mL甲醇、5mL水,5mL pH=6的水;
2)上样:加入样液,控制流速,不宜过快;
3)淋洗:10mL pH=4的水,20mL甲醇-甲酸( 6/4)洗去天然色素,10 mL pH=7的水洗至中性;
4)洗脱:15mL氨水-乙醇-水( 2+7+1)洗脱,收集洗脱液,将洗脱液置于80度水浴挥干,用水定容至5mL,上机测定。
1.4标样与样品检测的色素的色谱图按设定好的仪器条件,对标准样品进行了分析测定,其柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红色谱图如下:
1.5红茶假阳性的判别红茶由于含有大量的氨基酸、咖啡碱、天然色素等物质,这些物质都干扰了红茶中人工合成着色剂的测定,很容易出现假阳性色谱图。因此考虑使用着色剂的各自最大吸收波长进行验证与排除。样品实验表明,在
液相色谱的紫外检测器的254nm时,红茶都会在日落黄的保留时间内都出现很大的假阳性色谱峰;而在
液相色谱紫外检测器波长设为日落黄最大吸收波长480nm测定时,则无色谱峰,因此,红茶紫外检测在254nm下测定日落黄会出现假阳性。
3.样品的加标回收试验:
样品及样品的加标回收试验按上述1.2及1.3的条件进行试验,检测波长为480nm,样品均未检出合成色素,
加标试验见表2。
从上表可以看出:使用月旭Welchrom® PA,1g/6mL;货号WSP050306固相萃取小柱,及色谱柱:月旭Ultimtae XB-C18, 4.6×250 mm, 5μm;货号:00310-02043,序列号:w13211570取得了较好的分析效果,回收率在(86~95)之间,较国标的分散萃取操作简单,方便,回收率也有极大的改善。