常见错误之一——色谱柱用粒径5μm的颗粒填充
回想一下,多年来标准HPLC分析柱(250mm×4.6mm)都是采用5μm 粒径颗粒填装的,然而,事实上3μm 粒径颗粒填装的色谱柱(150mm×4.6mm)具有更好的分离效果及更短的分析时间。同时,现在许多实验室标配的色谱仪是超高压液相色谱(UHPLC)和液相色谱-质谱([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]LC-MS),所以色谱柱更应该换成3μm 或sub-2μm 填装的色谱柱。常见错误之二——使用4.6mm内径色谱柱(1mL/min)
自20世纪70年代初,HPLC分析柱的“标准”内径就已经是4.6mm了,而近年来,在努力减少溶剂消耗、节约样品的目标下,许多实验室已经开始将3.0mm内径的色谱柱作为更好的选择,来代替使用4.6mm内径色谱柱了。如果使用现代的中间分散HPLC仪的话,柱率和柱外频带展宽的效果通常不会受到任何负面影响。总之,使用较小内径的色谱柱是有利的,在梯度洗脱条件下可以获得更高的分辨率。常见错误之三——对HPLC的流动相进行过滤
通常经净化系统所得的HPLC级溶剂和水已经足够干净了,如果我们再给它一次额外的过滤,那只会适得其反,引入不必要的化学污染。事实上,许多实验室都有自己的一套色谱仪器保养维修计划,每年对HPLC系统中的过滤器进行更换,所以我们没有必要再对流动相进一步过滤。常见错误之四——使用缓冲剂流动相
当分析酸性或者碱性分析物的时候,有必要对流动相进行酸化或者碱化。简单的流动相如含0.1%(体积比)甲酸的水溶液,仅需要将1mL甲酸定容到1升水中即可迅速制备。同样,含0.1%(体积比)氨的水溶液可以用于多种高pH值兼容柱。当使用低硅羟基活性柱时,无论用低还是高pH值流动相运行,缓冲剂其实都很少用到,包括以流动相A为稀释剂配制进样样品溶液时。常见错误之五——每次试验都重新配制新的参考标准溶液
在药品的质量控制实验室中,往往每个试验都会重新配制新的参考标准溶液,实际上这是没有必要的。许多药物在低温和适当的贮存条件下溶液具有足够的稳定性。所以你可以一次性配制几百个合格的参考标准溶液置于HPLC小瓶中,然后冷藏或冷冻贮存供以后分析用。而对于试验结果的长期稳定性研究来说,更应该采用由同一个原始溶液配制而成的标准溶液。当然,对于通常的试验,标准溶液的储存条件下的稳定性(保质期)是应该经过验证的,并记录首次配制时间。这里值得我们注意的是:所有的操作都需要做好记录。常见错误之六——对样品瓶进行摇动
摇动(或反转)样品瓶会在样品瓶盖下面形成一层液体膜,这会对HPLC自动进样器造成干扰以至于给出一个混乱的试验结果。所以即使在排除了故障的情况下,也要始终警惕这一点。常见错误之七——使用不锈钢卡套作为柱的接头
HPLC系统通常安装有不锈钢接头和套圈,大多数情况下它们工作得都很好,但是它们不适合用于需要频繁更换色谱柱时的连接。