主题：【分享】重现性差代表液相色谱故障了？

重现性差是液相色谱分析中出现故障的一个准确信号，首先在分析那些满足系统适配性的样品时出现的问题，分析工作者使用这些样品测定时，液相色谱方法及其系统能否很好的工作？其次，测得的峰面积值变化范围与通常观察到的测量误差比较起来是否相差很大？

系统适配性分析试验中的奇怪的谱图

问题

用我的方法进行系统适配性样品性能试验时遇到了费解的问题。 我分析测定了储存于不同强制条件下样品的稳定性。我将所有的标准品都制成同一溶液并立即冷冻在--78℃温度下 。每隔一段时间取出 3小瓶做系统适配性分析试验，取另一小瓶作为校准标样.每一小瓶中都配有一个分析物和一个内标物。

系统适配性试验需要从每个系统适配性标样小瓶中取出一份，进行3次进样。该法要求保留时间的重现性以及分析物与内标物峰面积比值（ 响应因子）的相对标准偏差（RSD）在一定的范围之内。

我用该法在最后两次测定时发现了奇怪的色谱图形。 在所有情况下， 前两个小瓶进样的响应值相同，但第3个小瓶进样的峰面积明显变小。在每个小瓶中， 峰面积是恒定的， 所有进样的保留时间是相同的，而且响应因子的 RSD是良好的 。这个分析是满足系统适配性要求的， 后来对强制样品的分析也都得出所期待的结果。 唯一奇怪的问题是，系统适配性

进样的第 3 个小瓶的峰面积响应出现阶跃变化，这是怎样产生的？

首先，让我们再做几次试验以考察与标样有关的潜在问题，例如， 究竟是3号小瓶的内容物有问题， 还是它所处的位置或进样顺序有问题。若仍有标样，应按第1次3个小瓶的顺序重新进样，并观察是否出现相同的现象。 然后重新安排这 3个小瓶的进样顺序（ 例如改成 2号、 3号、1号的顺序），观察究竟是小瓶内容物还是进样顺序引起了峰响应的改变。

若因稀释错误使 3 号小瓶内所装的分析物和内标物浓度变低， 则峰面积应该下降，但响应因子应该相同。 浓度低的可能性很小， 因为所有小瓶中的样品都是在同一时间制备并储存在相同条件下的。重新检查这些系统适配性标样的制备过程，可能会揭示出问题的根源。

若低响应是由小瓶的位置而不是由于装瓶时样品浓度不同所致，则问题的出现可能是由自动进样器或色谱柱的填充状况变化造成的。这种可能性可以通过第 3次进样后将前两个小瓶中的样品重新进样来检查。若响应仍然很低，应该考虑逻辑线路方面的问题。若响应回到正常值，就将第3个小瓶样品再重新进样一次。

根据我的经验，系统填充情况的变化不是像你观察到的阶跃变化， 而是一个渐变的过程。 例如，由于在柱内硅醇基与碱性官能团之间的相互作用使分析物的峰产生严重拖尾。有时在正常浓度或高浓度情况下 ，进几次标样能使硅醇基失活， 并可改善下几次进样的峰形 。同样，若系统中某一部位还在吸附样品，就必须在获得正常响应之前进几次样 ? 使活性部

位饱和。无论如何，在这种情况下，流出图上的峰面积是逐渐增大而不是逐步减小的，因此我并不认为这种解释是适合于现有问题的。

我猜想自动进样器的第 3个位置可能出了毛病。如果发生了这种情况，以后的工作就应该避开那个位置。同时也要仔细检查控制程序， 以确保对第 3个小瓶的较少进样不给出指令。这两个问题也可以通过使用其它方法用另一个标样来检查，例如，在标准条件下使用色谱柱试验样品进行测试，就能排除任何与方法有关的化学问题，而把问题集中在机械或电子学方面。

这里，没有给出任何明确的答案。通过仔细研究，寻找峰面积响应趋势的数据，尤其是分析物和内标物的数据， 就有可能发现问题。

峰面积的重现性很差

问题

用我的方法给出的峰面积的重现性很差。 保留时间很好，但峰面积的 RSD 已达 5%~10%，可我常见到的只有 1%~2%。 我在这个与出现问题有关的系统中什么都没有改动。这个系统由一个低压混合系统 、一个自动进样器、一个C8色谱柱和一个UV 检测器组成。等度洗脱的流动相在线混合，流动相为PH3 的磷酸缓冲液和甲醇。

峰面积的重现性依赖于自动进样器操作的一致性。所以我认为这就是你的问题的根源。首先，应尽量保持进样的始终如一。 通过进已知标样的相同样品最容易查出主要原因，问题可能就出在样品瓶上。

样品必须是均匀的。高盐浓度的样品基体容易分层，冷冻时会混合不匀 。万一有分层存在， 就要来回摇动样品瓶? 使瓶中内容物混合均匀。样品瓶太满、 密封太紧可以产生不同的结果。

吸样时， 样品瓶中形成一定真空，造成吸样困难。这种条件就造成了进样量的差异。通常瓶中内容物不超过总容积的 1/2~3/4为最佳。

如果样品溶剂容易挥发， 那么样品瓶密封不良也能出现问题。 样品溶剂的蒸发损失可以导致每次进样的样品浓度不同。

滞留在自动进样器针头里的样品瓶隔膜小片移动时， 能起到开合的挡板作用 。这种情况可产生不良的重现性， 或者极端地说， 完全不能进样。 怀疑阻塞时可以冲洗进样管和进样针头， 用针头捅丝清除异物，或者更换新针头。 最好使用不能被针头穿切出小片的硅橡胶样品瓶隔膜。 贴面的隔膜似乎比别的材料更不容易被穿切出小片。

不适当地使用注射器和取样装置更容易出现重现性问题 。 例如，在我的实验室中把一些自动进样器设计成通过很长细内径的塑料管把样品从样品瓶转移到进样阀中，如果这个输送管中有气泡， 它们遇到阻力变化时会膨胀或收缩， 导致从样品瓶中吸取样品量的变化。 为了防止这一情况发生， 分析工作者在使用前应将溶剂彻底脱气并清洗进样管。有些自动进样器的设计是根据所要求的进样体积而使用不同规格的注射器 。

若注射器与样品量失配， 动作位置的失误会导致严重的误差， 因此要注意检查安装的注射器是否适当。若设计的自动进样器是从样品瓶吸取样品再传送到进样阀， 则问题可能出在进样阀上。 样品针头在进样口处必须密封良好， 否则样品会泄露损失。 应该调整或更换进样针头的密封圈以防泄漏 。

流路上的任何阻力都能产生反压， 造成进样针头周围泄漏。 应检查进样阀的每条通路， 尤其要保证废液导管畅通。否则， 样品溶液和缓冲液的蒸发会留下残渣， 逐渐堵塞废液导管。对进样阀组装不正也能产生反压， 使样品针头的密封圈泄漏。进样方式能影响峰面积的重现性，但自动进样要好于手动进样。 由于流体流动的特性，在定量管全充满情况下，当样品量至少为定量管体积的二三倍时，会产生精度的最高等级；而在定量管半充满情况下， 当样品量少于定量管体积的一半时， 精度最高。 由于这个原因，你应该从两个方面来检查， 即不仅要检查是否把合适的定量管安装在自动进样器上， 而且还要检查进样体积是否与所要求的精度等级相一致。

泄露也能影响峰面积精度，但泄露产生的问题与保留时间变小相似，因此这个情况不大可能成为你的问题的根源。这样，你可以领悟到进样精度问题有很多可能的原因。 我一开始就想仔细考察所有系统的设置，以保证你不出现误差，然后全面考虑上面列举的全部可能性， 看它们当中是否有一个是问题的主要原因。

一次只改变一种可能性， 你就会找出问题的真正根源 。这个方法能帮助你懂得今后怎样避免出现相同的问题。

进一个基体空白样品时会遇到的高压问题

问题

有时， 用我建立的一个高效液相色谱方法进一个基体空白样品时会遇到很高的压力 ，甚至自动停泵。 问题出在自动进样器上，因为如果卸下进样器出口管的连接接头， 压力是高的； 但断开从泵到进样器的给料管时，压力则正常。 通常，压力在几分钟内就能降至正常。 流动相是乙腈和 pH7的缓冲液 。 样品是高盐基体中的生物分子,样品在其制备期间被脱盐 。 是基体空白样中的盐引起这个问题吗 ?

解答

你观察到的压力增大很可能是由系统中盐的沉淀引起的。 应该知道盐的浓度和流动相的确切组成。当乙腈同盐和缓冲液混合时，溶解度很差是大家熟知的，例如，实验室分析工作者发现，水相含有25mmol/L  以上磷酸盐时, 乙腈浓度约大于80%就无法操作梯度系统了。有时，缓冲液与乙腈在主体溶液中混合不出现问题 ,但在线混合却有了溶解度问题，因为出现在混合界面的沉淀会使管道或滤片堵塞。

为了解决这个问题，采用两种方法之一；或者在进样前稀释样品基体 ，或者通过相同的步骤净化样品 。 若一定要进等量的样品基体， 就要把稀释倍数和进更大的样品体积结合起来， 例如，稀释基体4倍， 进样4次同量的基体。

还可以选择甲醇作为流动相中的有机溶剂。 盐和缓冲液在甲醇中比在乙腈中有更好的溶解度。 当然， 甲醇也许不能为你的方法提供所需要的色谱选择性， 因此使用这种溶剂也可能并不奏效。分析工作者应避免使用容易使液相色谱中的样品和缓冲液出现沉淀的各种条件。 电压升高或出现堵塞，充其量把系统冲洗一下即可解决， 但若在色谱柱中出现了沉淀， 你就应该更换色谱柱， 因为这种沉淀不大可能再被溶解除去。

小结

将所有变量保持恒定时， 用液相色谱方法对同一化合物的重复进样应得出相同的结果。每次进样在峰面积、保留时间或其它所测参数上的偏差大于正常系统误差时， 显然是一个或多个变量控制不当的确切标志。 本文系统地、一步一步地将问题孤立了出来并给出了合乎逻辑的校正方法。

来源：实验与分析