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最近做的一个实验,刚刚写完,未发表,在投稿之中。前言
碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22 和碱性嫩黄O都属于偶氮工业染料,主要用于腈纶、纺织品、纸张、皮革、家具等的染色
。这些染料具有致癌、致畸作用,对人体健康具有严重的危害。《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》及《中华人民共和国食品卫生法》规定,碱性橙禁止作为食品添加剂。由于这些染料在中性及偏碱性的条件下,与蛋白质吸附牢固,不易褪色,而且成本低廉,因此一些不法食品生产商使用这些染料对豆制品进行染色,使之色泽光亮,欺骗消费者
。
目前,豆制品中这几种碱性染料的检测方法有高效
液相色谱法
、
液相色谱-质谱法
、薄层色谱扫描法等,尚未见高效毛细管电泳电泳法同时测定这几种碱性染料的文献报道。高效毛细管电泳法作为一种快速、低廉、绿色环保的分析方法,在分析领域应用很广泛。本研究采用乙酸铵水溶液提取、固相萃取浓缩净化的前处理方法,建立了碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22 和碱性嫩黄O的毛细管区带电泳分析法,并应用与豆制品中的碱性染料的测定,方法准确可靠,简便快捷。
1 实验部分
1.1仪器与试剂
P/ACE MDQ型毛细管电泳仪(美国贝克曼库尔特有限公司),配有紫外检测器;未涂层熔融石英毛细管柱(40 cm,有效长度30 cm,内径75 μm,河北永年光导纤维厂); Turbo Vap自动浓缩仪(德国Biotage公司)。
碱性橙2 (99.6%)、碱性橙21(90.2%)、碱性橙22(95.4%)、碱性嫩黄O (79.0%)标准品(Dr Ehrenstorfer GmbH公司,德国); Oasis HLB固相萃取柱(美国waters公司);甲醇(HPLC),乙腈(HPLC),氨水(HPLC),乙酸铵(AR),磷酸二氢钾(AR);实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。
1.2 电泳条件
分离电压:25kV,分离温度:30℃,检测波长:210 nm,进样方式:压力进样(20psi,0.5s),运行缓冲溶液:40mmol/L磷酸二氢钾-20%乙腈(pH=2.5)。每次进样前按水、甲醇、水的顺序清洗毛细管各1min,然后用运行缓冲液冲洗2min。
1.3 样品前处理
1.3.1样品的提取
固体样品:将样品粉粹混匀,称取2 g(准确至0.001g)样品,置于10 mL具塞离心管中,加入5.00 mL提取液(50 mmol/L乙酸铵水溶液),超声提取30 min,3000 r/min离心10 min,将上清取出置于离心管中,再加入5.00 mL提取液提取一次,合并提取液后3000 r/min离心10 min后收集上清液,待过柱浓缩净化。
含油样品:将样品粉粹混匀,称取2 g(准确至0.001g)样品,置于10 mL具塞离心管中,加入5.00 mL提取液(50 mmol/L乙酸铵水溶液),超声提取30 min,3000 r/min离心10 min,将上清取出置于离心管中,再加入5.00 mL提取液提取一次,合并上清液后加入2 mL正己烷,涡旋振荡并萃取,弃去正己烷层,重复三次,待过柱浓缩净化。
1.3.2 样品的净化
分别以3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取小柱,将上清液5mL(氨水调至近中性)加入萃取柱中,3mL的水淋洗后,加入2 mL 氨水-乙腈(10:90,v/v)洗脱,收集洗脱液。上样和洗脱过程流速控制低于1 mL/min。将洗脱液于30℃氮气吹至干,准确加入1.00 mL乙腈水(25:75,v/v),漩涡混匀30 s后过0.22 μm滤膜后待测。
2 结果与讨论
2.1 检测波长的选择
将碱性橙2、碱性橙21、碱性22、碱性橙O的单标储备液分别用超纯水稀释成50 μg/mL。以超纯水为空白,分别在190-800 nm范围对各物质的单标应用液进行紫外可见吸收光谱扫描,这四种碱性染料在450 nm和210 nm处均有较强吸收。由于食品样品基体复杂,在可见区域有较大干扰,并且由于仪器限制,不能在450nm处进行检测,因此选择210 nm作为实验的检测波长。
2.2 电泳条件的选择
2.2.1 缓冲试剂和缓冲液pH的选择
缓冲试剂的选择主要由所需的pH值决定,而该pH值又因样品的性质和分离效率不同而不同
。在毛细管区带电泳中,所需的待测物质在离子状态下才能实现分离。这四种碱性染料均有氨基基团,在酸性条件下可解离,因此选择磷酸、磷酸二氢钾作为分析的缓冲试剂。
缓冲溶液的pH不仅能控制分析物的有效淌度,还控制着电渗流,同时对分析物的离子化程度有较大影响,因此是优化分离条件的重要因素。考察了40mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液在不同pH( 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5)时对分离效果的影响。由图1可见,随着缓冲液pH值降低,出峰时间、峰高和峰面积均增加。在实验范围内,pH值越低,4种碱性染料的分离越好。故最终选择缓冲液的pH为2.5。
.2.2 缓冲液浓度的选择
缓冲溶液浓度通过影响溶液的粘度和电渗流,进而影响样品的分离情况。一般情况下,缓冲盐的浓度越高,电渗流越低,迁移时间就会延长,分离度增加。但是,缓冲盐浓度的升高却会增加焦耳热,使峰形变宽,峰面积下降。实验分别考察了浓度20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L 磷酸二氢钾盐浓度的条件下时,被测的这4种碱性染料的迁移时间和分离度。随着磷酸二氢钾浓度的增加,四种碱性染料分离度增加,但电流同时增加,迁移时间延长,因此综合考虑,选择40 mmol/L为最佳的磷酸二氢钾浓度。
2.2.3 添加剂的种类和浓度
添加有机溶剂,可以减少毛细管电泳的电渗流,降低焦耳热的产生,从而有利于物质的分离。有机添加剂通常选择其有较高的偶极矩和介电常数,并对被测物质有良好的溶解性。一般来说,甲醇、乙腈是比较合适的有机添加剂。本实验对比了不同有机溶剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮)对四种碱性染料的分离的影响。实验结果表明,添加甲醇、乙醇、丙酮的添加使峰形拖尾,同时迁移时间也明显增加,而添加乙腈能够明显改善峰形,增加分离度。因此本文进一步比较了不同乙腈比例对四种碱性橙分离的影响(图2)。实验结果表明,随着乙腈比例的增加,峰形明显改善,分离度增加,迁移时间减少。但过多的乙腈会容易在毛细管内形成气泡,造成基线波动,因此在综合考虑分离效果和基线波动等因素,最终选择添加20%的乙腈。
2.2.4 分离电压和温度
实验比较了分离电压15-30kV范围内时对四种碱性染料的分离效果的影响。随着分离电压的升高,迁移时间缩短,但基线噪声随之增大。最终选择了20kV作为分离电压。
毛细管的柱温对迁移时间、电渗流、测量重现性都有一定的影响
。本实验分别比较了分离温度为20℃、25℃、30℃、35℃下四种碱性染料的分离情况,在分离温度为30℃时,四种碱性染料有较好的分离度并且迁移时间较短。优化好的标准色谱图见图3。
2.3 样品前处理条件的选择
2.3.1 提取液的选择
文献
中报道用于提取这四种碱性染料的溶液有乙酸-甲醇(10:90,v/v)、氨水-甲醇(10:90,v/v)、乙醇、乙醇水溶液(30:70,v/v)、乙酸铵水溶液等。本文以空白豆腐皮为样品进行加标,考察了这些溶液对这四种碱性染料的提取效果。实验结果表明,50 mmol/L的乙酸铵水溶液回收率最高,同时便于下一步的浓缩净化过程,故选择50 mmol/L的乙酸铵水溶液作为提取溶液。
2.3.2 固相萃取柱的选择
在碱性染料净化的固相萃取柱的选择上,HLB柱
、C
18柱
、MCX柱
均有报道本实验考察了这三种固相萃取柱的净化效果。结果表明,MCX固相萃取柱与碱性橙的结合能力很强,难以洗脱,必须使用二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂才能洗脱,HLB固相萃取柱在杂质的去除和回收率上均优于C
18固相萃取柱。因此选择HLB作为净化固相萃取柱。
2.3.4洗脱溶剂的选择
实验考察了不同类型洗脱剂(氨水甲醇溶液、氨水乙腈溶液、氨水丙酮溶液)的洗脱效果,结果表明,氨水甲醇的洗脱能力差,不能够将碱性嫩黄O完全洗脱下来,而氨水丙酮洗脱能力太强,洗脱杂质多,不利于检测,而氨水乙腈在保证将这四种碱性染料洗脱下来的前提下,洗脱的杂质少,最终选择氨水乙腈作为洗脱溶剂。
进一步比较了不同浓度氨水-乙腈(1.0%、2.5%、5.0%、7.5%,v/v)洗脱能力,从图4可见,随着氨水比例的增加,碱性橙21、碱性橙22的回收率有明显上升。当到达5%时,这四种碱性染料的解析效率达到最高,最终选择5%氨水乙腈作为洗脱溶剂。
2.4 方法性能考察
2.4.1 回归方程、线性范围、检出限和定量限
分别取标准储备液适量,配制5个浓度水平的标准系列,在优化的电泳条件下,由低浓度到高浓度分别进样测定,从而得到各物质的回归方程以及线性相关系数。回归方程中
y表示峰面积(AU•min),
x表示浓度(mg/L)。根据3倍信噪比和10倍信噪比对应的样品中待测物质含量,确定方法检测限和定量限,结果分别0.5-0.7mg/kg和1.7-2.3mg/kg。
表1方法的线性范围、回归方程、检出限和定量限 Tab. 1 Linear ranges, correlation coefficients, limit of detection, limits of quantification of the method |
检测物质 | 线性范围
ρ/(mg/L) | 回归方程 | 相关系数 | 检出限 ω/(mg/kg) | 定量限 ω/(mg/kg) |
碱性橙2 | 1.25-50 | Y=1830.4X-37.56 | 0.9988 | 0.5 | 1.7 |
碱性嫩黄O | 1.25-50 | Y=1744.8X-901.85 | 0.9978 | 0.6 | 2.0 |
碱性橙21 | 1.25-50 | Y=1286.2X-600.96 | 0.9977 | 0.7 | 2.3 |
碱性橙22 | 1.25-50 | Y=2115.1X-956.22 | 0.9979 | 0.5 | 1.7 |
2.4.2 精密度实验
取浓度为25 μg/ml的4种碱性染料的混合标准溶液,按本法进行测定,在一天内连续测定6次,以峰面积的相对标准偏差(relative standard derivation,RSD)考察方法的日内精密度。连续6天进行测定,考察方法的日间精密度。由表2可见,这4种碱性染料的日内精密度(RSD)为1.55%-3.55%,日间精密度(RSD)为2.48%-10.58%。
表2方法的日内和日间精密度(n=6) Tab. 2 The intra- and inter-day precision of the method(n=6) |
检测物质 | 日内精密度 | | 日间精密度 |
测定范围 ρ/(mg/L) | 测定均值 ρ/(mg/L) | RSD /% | | 测定范围 ρ/(mg/L) | 测定均值 ρ/(mg/L) | RSD /% |
碱性橙2 | 23.8-25.8 | 24.8 | 3.05 | | 21.6-26.7 | 24.7 | 9.58 |
碱性嫩黄O | 24.2-25.9 | 24.8 | 2.43 | | 23.5-27.9 | 25.4 | 6.57 |
碱性橙21 | 24.8-26.0 | 25.4 | 1.79 | | 23.8-26.8 | 25.3 | 4.36 |
碱性橙22 | 25.1-26.3 | 25.6 | 1.55 | | 24.5-25.8 | 25.4 | 2.48 |
2.4.3回收率实验
取12份平行样品,其中3份测定本底值,其余分别加入3个不同水平的混合标准溶液,每个水平测定三个平行样品,进行加标回收实验,并计算峰面积的RSD值来考察样品溶液的精密度。实验结果(表3)表明,本法的加标回收率范围为73.6%-93.1%,加标样品的RSD范围为1.28%-4.69%,能够满足分析测定的要求。
表3.方法的加标回收率(n=3) Tab. 3. The spiked recoveries of the method (n=3) |
检测物质 | 本底值 | 加入量 | 测量值 | 回收率 /% |
RSD
/% |
ω/(mg/kg) |
碱性橙2 | ND |
10.0 |
7.85 | 78.5 | 3.56 |
40.0 |
33.7 | 84.3 | 2.53 |
80.0 |
74.5 | 93.1 | 1.96 |
碱性嫩黄O | ND |
10.0 |
7.92 | 79.2 | 4.14 |
40.0 |
32.6 | 81.5 | 2.56 |
80.0 |
68.5 | 85.6 | 3.65 |
碱性橙21 | ND |
10.0 |
8.12 | 81.2 | 4.69 |
40.0 |
34.1 | 85.3 | 2.47 |
80.0 |
70.3 | 87.9 | 1.32 |
碱性橙22 | ND |
10.0 |
7.36 | 73.6 | 3.28 |
40.0 |
31.2 | 78.0 | 1.56 |
80.0 |
69.4 | 86.8 | 1.28 |
ND表示未检出
2.5方法应用
应用本法分析检测了腐竹和豆腐干共9种豆制品中的碱性染料,结果均未检出。图5为不同种类样品及其加标后的电泳图。
3小结本实验对毛细管电泳的仪器条件(分离电压和分离温度)和缓冲液条件(pH、浓度、添加剂等)进行了优化,在6.5min内实现了对四种碱性染料的快速分离。对样品前处理的条件(提取条件、固相萃取条件)进行了优化,结果表明,方法精度度和准确度能够满足食品测定的要求。对实际样品进行了测定,结果表明本方法简单、准确、快速,适用于食品样品碱性染料的分析。