主题：【分享】反相色谱常用改性剂及使用

最近有人问我液相添加三氟乙酸是为什么或者别的方法中添加甲酸是为什么，这个问题解释起来当然比较理论，一句话回答就是改善峰形或增强保留。反相C18柱能解决液相色谱80%的分离，但是大部分化合物都需要加入一些改性剂来改善分离，可以参考公众号以前发的文章中有提到极性化合物在反相色谱中的分析方法。这些改性剂起的作用主要是增强保留、消除次级保留效应、提高质谱中离子化效率等。
增强保留

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化学中“相似相溶”几乎是通用的准则，极性化合物在反相柱保留很差，没有保留谈何分离呢，极性化合物在水相溶剂中是质子化的，加入弱酸或弱碱可以抑制解离，这样就增强保留了，对于酸性化合物，如果流动相的pka值低于分析物的pka值，是可以有效抑制解离的。下表是常见的一些用于液相的酸、碱及其缓冲盐。

液相色谱推荐使用的缓冲盐
添加物/缓冲盐	pka	缓冲范围	挥发性	备注
三氟乙酸	0.3		有	离子对添加物，会引起质谱信号的离子抑制,在0.02%~0.1%的范围内使用
乙酸	4.76		有	在0.1%~1.0%范围使用
甲酸	3.75		有	在0.1%~1.0%范围使用
乙酸/乙酸铵	4.76	3.76~5.76	有	1~50mM范围使用
甲酸/甲酸铵	3.75	2.75~4.75	有	1~50mM范围使用
磷酸盐	2.15	1.15~3.15	无
磷酸盐	7.2	6.20~8.20	无	PH7以上，最好降低温度和浓度且使用保护柱
氨水	9.2	8.20~10.2	有	浓度保持在10mM以下，温度保持在30℃以下
碳酸氢铵	10.3（HCO3-）	6.8~11.3	有	5-10mM范围，用于质谱时，源温度要大于150℃，用氢氧化铵或醋酸调节PH,在PH10有很好的缓冲能力
	9.2(NH4+)
	6.3（H2CO3）

      减少或消除次级保留效应

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硅胶键合柱中会有部分残留硅羟基，这些硅羟基对某些化合物产生次级保留效应，次级保留效应会引起峰拖尾。次级保留效应主要有两种，一种是是由质子化的样品分子和质子化了的硅羟基发生离子交换产生，另一种是反相填料被金属如铜、铁污染，能与金属离子螯合的化合物也会产生次级保留效应。关于次级保留效应，推荐感兴趣的可以找到“色谱仪器维护与故障排除”这本书来看，解决好次级保留效应可以解决很多拖尾峰的问题。

尤第一种对弱碱性化合物影响比较大，这时需要加入一些改性剂来消除次级保留效应，消除原理和之前提到抑制化合物质子化是一样，一般是碱性化合物加入1~20mM胺类（三乙胺），酸性化合物加入1%乙酸来作为改性剂；对于金属的影响，需要用金属螯合剂来冲洗色谱柱来消除干扰。此外，现在有很多全封端的色谱柱，对于这类化合物可以选用全封端的色谱柱来避免残留硅羟基的影响。
增强检测器响应

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检测器是整个分析过程中的眼睛，前面分离再好，眼睛看不到也是白瞎的，而使用质谱作为检测器的时候，在质谱中有没有响应是很关键的问题，在定量过程中质谱响应高意味着检测灵敏度就高。质谱检测的第一步是使目标物离子化，极性弱的化合物在质谱中的响应很多都不高，甚至有的都没响应，一般有经验的分析员都会说加点酸试试吧。加入一些弱酸、弱碱或者甲酸铵、乙酸铵等，会使目标化合物响应提高，这里需要注意三氟乙酸加入量不宜超过1%，超过会大大抑制电离，尤其是在负离子模式下。
其它需要注意的问题

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使用改性剂需要注意加入量，普通硅胶柱能耐受的PH值是2~8，PH<1，键合相会水解；PH>8.5，会引起基体硅胶的溶解。在碱性条件下，色谱柱柱效下降是非常明显的（小编在这方面是有过沉痛的教训的）。
需要考虑对检测器的影响，如不挥发的盐和酸不适合用在液相-质谱联用系统上；紫外检测器时，需要考虑改性剂的截止波长，截止波长最好低于选用的检测波长。