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七月初参加了仪器信息网举办的饮料中柠檬黄日落黄的草根比对,8月初我们收到了举办方反馈回来的结果,如下
我们柠檬黄结果偏离了指定值很多。柠檬黄的结果为什么会出现这么大的偏离,是实验过程存在问题,还是数据处理问题? 我们初步怀疑是采用的254nm紫外光区检测波长存在干扰,因此再次向举办方申请样品,通过实验来查找问题所在。
由于本次实验是与检科院的能力实验样品一起做,检科院的样品过于稠厚,无法固相萃取,所以我们做了一些改变
1根据国标采用了聚酰胺粉吸附净化洗脱
2洗脱液由乙醇-氨水-水改成氨水-甲醇溶液
3检测波长除254nm外,增加检测波长430nm,480nm
实验准备
前处理用: 20%柠檬酸溶,实测PH=1.38
甲酸-甲醇液(体积比4+6)
氨水-甲醇(2%):(200ml容量瓶放4ml浓氨水加甲醇定容至刻度),
PH=4水:100ml纯水加2滴20%的柠檬酸液,实测PH=3.30
PH=6水:直接用纯水,实测PH=6.02
聚酰胺粉,G3垂融漏斗
流动相:
甲醇:Amethyst Chemicals HPLC/ACS
乙酸铵溶液:0.02mol/L,0.45μm滤膜抽滤后使用
标准品 中国计量科学研究院购买食用合成色素柠檬黄溶液标准物质(编号GBW(E)100001a),浓度为0.500 mg/mL,食用合成色素日落黄溶液标准物质(编号 GBW(E)100003a),浓度为0.500mg/mL
标系配制 1预实验配制20ug/mL的标准点进样,取样品过0.45μm滤头直接进样,粗略估计样品中目标组分含量范围,确定标准曲线的范围
2取10mL比色管5个,加入柠檬黄标准溶液各0.1,0.2, 0.4 ,0.,6, 0.8mL纯水定容至10mL,
标准系列溶液 柠檬黄(μg/mL)5 10 20 30 40
仪器与设备 戴安
液相色谱(P680 HPLC) UVD170U紫外检测器
VIS-1: 254nm VIS-2 : 430nm VIS-3: 480nm
色谱柱:安捷伦柱 5μm 4.6*250mm
样品前处理 1
. 根据样品中色素含量的高低,在千分之一电子天平上称样5-10g于50ml玻璃离心管,记录重量,然后称重1g聚酰胺粉用5ml水混匀后加入样品管,再用5ml水洗涤后一并加入,定容到25ml,每个样品管涡旋2min,静置1小时以上,再涡旋2min(如时间紧,可涡旋一次)
2
.将离心管中样品振摇混匀后,倾入G3垂融漏斗,尽量搅匀,使固形物均匀下沉形成厚度一致的聚酰胺层,便于除杂洗脱
3. 聚酰胺混合液在垂融漏斗中静置沉降一会后,真空抽走液体,进入洗涤程序
A:用pH=4的水,每次10ml洗涤2次,5ml洗涤1次,可真空抽提
B:用甲醇-甲酸溶液,每次10ml洗涤2次,5ml洗涤1次,可真空抽提
C:用纯水洗涤,至流出液呈中性,每次10ml洗涤3次以上,可真空抽提
4. 解吸 用2%的氨水甲醇液解吸,首次加入7ml解吸液,不要抽提,通过重力自然洗脱,收集于10ml比色管,尽量使聚酰胺层洗至无色,置氮吹仪吹净甲醇和氨,近干,加纯水定容至10ml待测
液相色谱分析(进样20μL)
1 标准曲线回归方程 | 254nm | 430nm | 480nm |
柠 檬 黄 | ŷ=14.842x+5.420 | ŷ=15.208x+5.929 | ŷ=3.681x+2.255 |
r=0.9998 | r=0.9998 | r=0.9999 |
2样品分析 | | 柠檬黄 |
直接进样 | 聚酰胺粉净化 |
254nm | 峰高 | 534.72 | 536.05 | 221.52 | 221.65 |
结果(mg/kg) | 70.16 | 28.62 |
430nm | 峰高 | 244.91 | 243.76 | 227.38 | 227.51 |
结果(mg/kg) | 30.80 | 28.62 |
480nm | 峰高 | 61.03 | 61.05 | 55.63 | 55.68 |
结果(mg/kg) | 31.38 | 28.50 |
从数据可以看出,直接进样检测,结果是偏高的,特别是254nm处,聚酰胺粉净化后进样结果都在可接受范围
注:样品指定值 柠檬黄
(mg/kg):28.3±1.41
回收率
| | 柠檬黄 |
| | 样品 | 样品加标(10ug/ml) |
254nm | 峰高 | 197.28 | 197.58 | 344.36 | 343.36 |
浓度(ug/mL) | 12.93 | 12.95 | 22.84 | 22.77 |
均值(ug/mL) | 12.94 | 22.805 |
回收率(%) | 98.6 |
430nm | 峰高 | 202.56 | 202.78 | 353.61 | 352.36 |
浓度(ug/mL) | 12.93 | 12.94 | 22.86 | 22.78 |
均值(ug/mL) | 12.935 | 22.82 |
回收率(%) | 98.8 |
480nm | 峰高 | 49.49 | 49.73 | 85.83 | 85.64 |
浓度(ug/mL) | 12.83 | 12.90 | 22.70 | 22.65 |
均值(ug/mL) | 12.865 | 22.675 |
回收率(%) | 98.1 |
结果分析 从结果来看,采用聚酰胺粉直接净化,柠檬黄在三个波长检测的结果一致,254nm波长处并未出现我们最初怀疑的紫外区的吸收干扰,这使我们感到困惑,第一次出现的结果偏高的原因在哪?
由于此次实验和上次相比,我们改变了一些条件,为了重现上次的实验过程,我们又重新采用6ml固相萃取柱作前处理,并分别采用两种解吸液解吸,验证不同的解吸液对实验结果的影响。
结果见下表
| | 柠檬黄 | 日落黄 |
乙醇-氨水-水 | 氨水-甲醇 | 乙醇-氨水-水 | 氨水-甲醇 |
254nm | 结果(mg/kg) | 37.2 | 39.0 | 93.9 | 96.0 |
430nm | 结果(mg/kg) | 27.9 | 29.2 | 93.9 | 96.1 |
480nm | 结果(mg/kg) | 28.3 | 29.5 | 95.1 | 97.3 |
对比实验数据发现采用固相萃取柱净化,柠檬黄在254nm处的检测结果明显偏高同时实验结果显示,两种解吸液在固相萃取柱上解吸,氨水-甲醇液解吸液的结果略高于乙醇-氨水-水的萃取结果,由于数据偏少,这个结论有待于更多的实验确认。
所有数据汇总如下表 | 柠檬黄 |
| | 聚酰胺粉净化 | 固相萃取柱萃取 |
254nm | 峰高 | 221.52 | 221.65 | 274.27 | 275.36 |
浓度(ug/mL) | 14.56 | 14.57 | 18.97 | 19.05 |
结果(mg/kg) | 28.6 | 28.6 | 37.12 | 37.28 |
430nm | 峰高 | 227.38 | 227.51 | 221.87 | 224.01 |
浓度(ug/mL) | 14.56 | 14.57 | 14.83 | 14.98 |
结果(mg/kg) | 28.6 | 28.6 | 29.0 | 29.3 |
480nm | 峰高 | 55.63 | 55.68 | 54.55 | 55.10 |
浓度(ug/mL) | 14.50 | 14.51 | 15.00 | 15.17 |
结果(mg/kg) | 28.5 | 28.5 | 29.4 | 29.7 |
由此可以看出我们在七月初参加的饮料中草根对比试验中,采用固相萃取柱净化,并以254nm作为检测波长,色素柠檬黄检测结果确实会偏高。这种现象是这一品牌固相萃取柱特有的现象还是共同的现象,我们又对比做了另外一品牌固相萃取柱,结果如下:
| | 柠檬黄 |
固相萃取柱(品牌A) | 固相萃取柱(品牌B) |
254nm | 结果(mg/kg) | 37.12 | 37.28 | 38.59 | 38.43 |
430nm | 结果(mg/kg) | 29.02 | 29.32 | 28.85 | 28.85 |
480nm | 结果(mg/kg) | 29.35 | 29.69 | 29.14 | 29.12 |
从数据可以看出,采用固相萃取柱净化,柠檬黄在254nm处的检测结果会明显偏高,对此我们怀疑是不是固相萃取柱本身会带入在紫外区254nm处有吸收的物质影响检测结果,于是加做了全程含固相萃取柱净化流程的空白实验,品牌A和品牌B固相萃取后空白液254nm吸收谱图如下:
由上述谱图看出两种固相萃取柱空白解吸液在254nm处柠檬黄吸收值为零,也就是固相萃取柱本身并未带入254nm处有吸收的成分,那么样品中柠檬黄采用固相萃取净化,选择254nm测试结果偏高的到底是什么原因?此次实验仍未找到结论,只是发现样品中色素柠檬黄采用固相萃取净化,在254nm处检测存在很大风险
综上所述,针对样品中色素柠檬黄的检测,:一是可采用聚酰胺粉直接净化,二是采用430nm或480nm波长作测试波长。