1.3 毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)--分离分析方法
CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的,其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽,使电泳效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速,是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。CE根据应用原理不同可分为以下几种;毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis,CZE)、毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)毛细管凝胶电泳(CapillaryGelElectrophoresis,CGE)和胶束电动毛细管层析(Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC)等。
1.3.1 毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)
CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定,比传统凝胶电泳更准确。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应,影响峰形与电泳时间,针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进,如调节电池泳液的PH值,使与硅醇反应的极性基团减少;改进毛细管柱材料的组成,针对多肽性质的不同采取不同的CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽,确定了小肽分析的基本条件,即在低PH条件下,缓冲液中含有一定浓度的金属离子如Zn2+等,此时分离速度快而且准确。
1.3.2细管等电聚电泳(Capillary Isleletric Focusing,CIEF)
由于不同的蛋白、多肽的等电点(PI)不同,因此在具有不同pH梯度的电泳槽中,其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来,而与其他肽类分离开来。CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多,主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离,如对rHG不同异构体分离。由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。
1.3. 3毛细管凝胶电泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基于分子筛原理,经十二烷基磺酸钠(SDS)处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前,又有一种非交联欢、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的分离分析,此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离,这种凝胶易于灌注,使用寿命长,性质较为稳定。
1.3.4胶束电动毛细管层析(Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC)
MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂,如SDS,使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽,阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束,从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质,可使用权含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用,从而利用疏水作用使多肽得到分离。
1.4多肽蛋白质分离工程的系统应用
以上提到的分离多肽的技术在实际应用过程中多相互结合,根据分离多肽性质的不同,采用不同的分离手段。特别是后基因组时代,对于蛋白质组深入的研究,人们对于分离多肽及蛋白质的手段不断改进,综合利用了蛋白质和多肽的各种性质,采用包括前面提到的常规蛋白多肽提取方法,同时利用了高效
液相色谱,毛细管电泳,2-D电泳等手段分离得到细胞或组织中尽可能多的蛋白多肽。在蛋白质组学研究中系统应用蛋白和多肽分离鉴定的技术在此研究中即是分离手段也是分析方法之一。特别是以下提到的质谱技术的发展,大大的提高了蛋白多肽类物质的分析鉴定的效率。
2 分析方法
2.1 质谱分析(Mass Spectrometry, MS)
MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用,特别是在分离纯化后的在线分析中,MS的高敏性、快速性特别适合多肽物质分析鉴定。其中连续流快原子轰击质谱(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB)和电雾离子化质谱(Electrospray Ionization, EIS)是近几年发展起来的新方法。
2.1.1连续流快原子轰击质谱(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB)
cf-FAB是一种弱离子化技术,可将肽类或小分子量蛋白离子化成MH+或(M-H)形式。主要应用于肽类的分离检测,其具有中等分辨率,精确度大于+0.2amu,流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在测定使流动相需加0.5%-10%基质如甘油和高有机溶剂成分,使样品在检测探针处达到敏感化。cf-FAB常与HPLC、CEZ等方法结合使用达分离分析的目的,许多多肽的cf-FAB分析方法已经建立,并得到很好的应用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。证明L-Pro在保持小肽构相稳定性。连接分子方面具有重要意义。
2.1.2 电雾离子化质谱(Electrospray Ionozation,EIS)
EIS可产生多价离子化的蛋白或多肽,允许相对分子质量达1×105蛋白进行分析,分辨率在1500-2000amu。精确度在0.01%左右。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线分析,且需要气化或有机溶剂使样品敏感化。利用EIS与HPLC联合分离分析GH和血红蛋白均获成功,其也可与CEZ联合应用。
2.1.3 基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱(Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry,MALDI-TOF MS)
MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中精确测定测定分子质量的手段,特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定,灵敏度和分辨率均较高。它是目前蛋白质组学研究的必备工具。同时结合
液相色谱的联用技术可以高效率的鉴定多肽物质。特别是当各种原理的质谱技术串联应用时,不但可以得到多肽的相对分子质量信息,还可以测定它的序列结构,此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance,NMR)
NMR因图谱信号的纯数字化、过度的重叠范围过宽(由于相对分子质量太大)核信号弱等原因,在蛋白、多肽物质的分析中应用一直不多。随着二维、三维以及四维NMR的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,使NMR逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等分析中。但要应用于蛋白质分析中仍有许多问题需要解决,例如,如何使分子量大的蛋白质有特定的形状而便于定量与定性分析,如何减少数据处理的时间问题等。这些问题多有不少学者在进行研究。虽然在蛋白质分析中应用较少,NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的,可以克服上述蛋白质分析中的缺点而达到快速准确分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外,氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、场解析质谱、IR、UV光谱、CD、圆而色谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及免疫学方法等都已应用于多肽类物质的结果鉴定、分析检测之中。
以上简要的介绍了近几年多肽物质分离、分析的常用方法及最新研究方向。随着科学技术水平的不断发展,会有许多更新的分离分析手段不断涌现,因此这一领域的研究具有广阔的前景。