主题：【第十一届原创】【前处理】不同溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气对比分析

【前处理】不同溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气对比分析

前  言
橙汁饮料是一种添加一定量的天然橙汁、香料、甜味和酸味剂等成分制成的饮料。是最常见最受大家欢迎的饮品之一，味道可口，有一定的营养价值。但橙汁饮料的香气成分很复杂，香气化合物的极性相差较大，沸点范围很宽，所涵盖的化合物这类很多。也无法直接进样，需要进行适当的提取后供gc-MS分析。本文采用液液萃取--气相色谱质谱法分析橙味饮料里面挥发性香气组分，对比两种不同溶剂提取效果；利用Amdis质谱解卷积软件识别拆分共流出色谱峰，得到更纯净的质谱图，更利于下一步质谱检索的工作；并结合保留指数校正使质谱检索结果更为准确。并使用动态范围宽的FID内标法定量。
1试验部分
1.1 仪器与装置
安捷伦6890N/5973I气相色谱-质谱联用仪，带FID检测器，一根毛细管柱通过分流进入MS和FID。
液液萃取分液漏斗，K-D浓缩器。
1.2样品
样品：橙汁饮料，样品购于某超市。
乙醚，正戊烷和二氯甲烷均为色谱纯。氯化钠为分析纯。香气化合物标准品均来自Sigma-Aldrich等主要试剂公司，少数为原料精制标样。C6-C30正构烷混合标准物来自安谱。
1.3 gc/MS条件

1.3.1 色谱条件:
色谱柱：安捷伦HP-Innowax(60m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱
升温程序： 60℃，以3 ℃/min升至250℃，保持28 min；
载气：He, 纯度99.999%以上，流速1.8 mL/min;
进样口温度250℃，分流进样，分流比10:1; 进样量：1μl。
检测器：FID， 氢气：30ml/min, 空气：350ml/min, 尾吹：N2，30ml/min, 温度：270℃。
1.3.2质谱条件:
电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃。SCAN扫描范围：29-400。EMV：1498V。溶剂延迟3.6min（乙醚戊烷萃取溶剂）和4.8min（二氯甲烷萃取溶剂）
1.4样品处理及分析方法
液液萃取法（LLE）：准确称取约300g橙汁饮料样品，加入适当量内标物，加入30g固体氯化钠，用乙醚戊烷（1:1）或二氯乙烷40mlX4提取后，无水Na2SO4干燥后用K-D浓缩器浓缩到1ml。进样1微升进行gc-MS/FID分析。
在分析样品前，和样品分析完全相同的条件下，用0.05%的C6-C30的正构烷标样注射到gcMS，获得正构烷的保留时间，用于计算保留指数。分析样品后，用软件计算样品各个组分的保留指数，并和标样的保留指数对比来，结合质谱来定性。事先也用同样方法测定标样的保留指数备用。
2 结果与讨论
2.1 橙汁饮料液液萃取挥发性香气总离子色谱图（TIC）
两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE总离子色谱图（TIC）如下：

图1.  两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE总离子色谱图
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从上面图可以看到，乙醚戊烷（1:1）和二氯甲烷提取的色谱图的轮廓（profile）基本一致，但个别地方的峰有所不同。由于两种溶剂出峰时间不一样而使用不同的溶剂延迟时间，乙醚戊烷提取的色谱图可以看到4.8min前部分的组分，而二氯甲烷只能看到4.8min后的组分。如下图放大前20min的色谱图，更为明显。

图2. 两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE前20分钟总离子色谱图（TIC）
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对前10min色谱图标注

图3. 两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE前10分钟标注的总离子色谱图
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从上面标注的色谱图看出，用乙醚：戊烷（1:1）提取可以看到乙酸乙酯，乙缩醛，乙醇，2-butanone，2-methyl-TH-furan，丙酮，甲酸乙酯，甲基环己烷等。而二氯甲烷由于溶剂延迟晚而无法看到。
2.2数据处理：
先用Amdis质谱数据解卷积处理质谱数据，减少本底干扰，对共流出峰拆分，提取出大峰下面的峰或隐藏在里面的色谱峰。例如No.36-37: 20.31min, alpha-Copaene和Octanal；No.46-47, 24.095min, 4-terpinenol和caryophylene，No.66-67, 28.329, Germacrene D 和aldehyde C12等未分离合峰的解卷积拆分。同时用Amdis的MSL质谱数据库和工作站的PBM（L）质谱数据库检索，并结合保留指数来鉴定峰。所有保留指数均由标准样品测定。极少数没有保留指数的化合物，参照其它资料和以往的经验，在保证良好匹配度的情况下确认。由于FID的动态线性范围很宽，定量结果稳定，复杂的多挥发性组分一般用气相色谱FID来定量，而不用质谱总离子(TIC)来定量。用FID检测器的结果加校正因子计算香料香气挥发性组分的含量。
计算公式：
Ci =( Ai/As)*Cs*Fi/s
Ci为香气组分浓度（mg/kg）
Ai为香气组分峰面积
As为内标物的峰面积
CS为加入到样品的浓度（mg/kg）
Fi/s为组分i相对内标物的相对校正因子。
2.3  橙汁饮料香料香气挥发性成分

表 橙汁饮料挥发性香料香气成分表

			Concentration
	RT		P & E	CH2Cl2
NO.	(min)	Component Name
1	4.199	FURAN, 2-METHYL,TH-	0.022	0.000
2	4.248	ETHYL ACETATE	1.480	0.000
3	4.288	ACETALDEHYDE DIETHYL ACETAL	0.171	0.000
4	4.549	ALCOHOL	6.420	0.000
5	4.84	ETHYL PROPIONATE	0.035	0.000
6	5.86	PINENE, ALPHA-	0.268	0.270
7	5.96	ETHYL BUTYRATE	1.597	2.010
8	6.617	CAMPHENE	0.013	0.004
9	6.803	ALDEHYDE C 6	0.000	0.011
10	7.464	LIMETOL	0.000	0.007
11	8.385	CARENE, DELTA-3-	0.072	0.052
12	8.672	MYRCENE	2.003	1.514
13	8.81	PHELLANDRENE ALPHA	0.092	0.078
14	9.198	TERPINENE, ALPHA-	0.000	0.030
15	9.449	HEPTADIENAL, 2,5,6-TRIMETHYL-2,4-	0.017	0.000
16	9.565	ISOAMYL ALCOHOL	0.000	0.015
17	10.074	LIMONENE	121.651	86.729
18	10.174	PHELLANDRENE BETA	0.160	0.120
19	10.283	MENTHATRIENE, 1,5,8-P-	0.015	0.008
20	11.134	TERPINENE, GAMMA-	0.379	0.063
21	11.265	MENTHATRIENE, 1(7),2,8-P-	0.046	0.027
22	11.916	CYMENE, P-	0.028	0.017
23	12.17	ACETYL METHYL CARBINOL	0.000	0.026
24	12.326	TERPINOLENE	0.145	0.085
25	12.513	ALDEHYDE C 8	0.423	0.323
26	13.117	NONATRIENE, 4,8-DIMETHYL-1,3E,7-	0.000	0.007
27	13.246	METHYL BUTENOL-3,2	0.000	0.024
28	15.359	ALLYL CAPRONATE	0.053	0.036
29	16.264	ALDEHYDE C 9	0.074	0.051
30	17.838	DIMETHYLSTYRENE, P-	0.026	0.008
31	18.316	ALCOHOL C 7	0.000	0.012
32	18.612	FURFURAL	0.085	0.323
33	18.867	CUBEBENE, ALPHA-	0.000	0.038
34	19.372	OCTYL ACETATE, 1-	0.072	0.035
35	19.699	ISOOCTANOL	0.013	0.000
36	20.31	COPAENE, ALPHA-	0.018	0.090
37	20.31	ALDEHYDE C10	0.579	0.274
38	21.991	LINALOOL	1.533	1.152
39	22.313	ALCOHOL C 8	0.301	0.198
40	22.595	Menthenol-(1), 2-p-, trans-	0.000	0.040
41	22.609	MENTHEN-1-OL, E-2-P-	0.061	0.000
42	22.949	Acetaldehyd-3,8-p-menthandiolacetal	0.121	0.032
43	23.329	FENCHOL	0.059	0.039
44	23.869	ELEMENE, BETA-	0.000	0.054
45	23.956	CUBEBENE, BETA-	0.022	0.054
46	24.095	TERPINENOL, 4-	0.478	0.364
47	24.095	CARYOPHYLLENE	0.000	0.040
48	24.383	MYRCENOL	0.064	0.039
49	24.626	BICYCLO(3.2.1)OCTEN-6-ONE, CIS-4,7-DIMETHYL-3-	0.020	0.013
50	24.864	CYCLOCITRAL, BETA-	0.000	0.019
51	25.004	MENTHADIEN-1-OL, E-2,8-P-	0.000	0.069
52	25.013	BUTYRIC ACID	0.140	0.000
53	25.138	TERPINEOL, BETA-TRANS-	0.754	0.596
54	25.489	MENTHOL	0.029	0.015
55	25.654	METHYL 3-HYDROXYHEXANOATE	0.000	0.004
56	25.949	ALLOAROMADENDRENE	0.000	0.007
57	26.216	ALCOHOL C 9	0.037	0.030
58	26.486	CITRONELLYL ACETATE	0.013	0.012
59	26.571	MENTHADIEN-1-OL, Z-2,8-P-	0.029	0.024
60	26.722	FARNESENE, E-BETA-	0.000	0.016
61	26.928	ETHYL HYDROXYHEXANOATE-3-	0.000	0.062
62	27.004	TERPINEOL, BETA-CIS-	0.165	0.138
63	27.2	MENTHADIEN-4-OL, 1,8-P-	0.044	0.035
64	27.486	IONENE	0.017	0.000
65	27.657	TERPINEOL, ALPHA-	5.404	4.301
66	28.329	germacrene d	0.000	0.008
67	28.329	ALDEHYDE C12	0.075	0.044
68	28.622	VALENCENE	0.195	0.277
69	28.836	SELINENE, ALPHA-	0.029	0.047
70	28.846	MUUROLENE, ALPHA-	0.033	0.000
71	29.004	CARVONE	0.147	0.098
72	29.325	PIPERITOL, E-	0.037	0.024
73	29.435	PIPERITENOL, TRANS-ISO-	0.018	0.011
74	29.61	PIPERITENOL, CIS-ISO-	0.040	0.031
75	29.739	FARNESENE, 3E,6E-ALPHA-	0.000	0.020
76	29.925	GERANYL ACETATE	0.024	0.000
77	30.005	CADINENE, DELTA	0.123	0.145
78	30.086	CITRONELLOL	0.081	0.062
79	30.207	7-epi-.alpha.-selinene	0.022	0.019
80	30.624	MENTHADIEN-8-OL, 1(7),2-P-	0.029	0.017
81	30.826	PERILLA ALDEHYDE	0.210	0.126
82	31.16	MENTHADIEN-2-OL, TRANS-1(7),8-P-	0.040	0.015
83	31.285	NEROL	0.064	0.047
84	31.581	PHENYLETHYL ALCOHOL, 1-	0.015	0.012
85	31.815	nerol isomer	0.000	0.000
86	31.85	ISONEROL	0.013	0.000
87	32.482	CARVEOL L TRANS	0.090	0.065
88	32.71	CALAMENENE, TRANS-	0.000	0.001
89	32.71	PIPERITENONE, ISO-	0.022	0.019
90	32.926	GERANIOL	0.252	0.163
91	32.926	CYMENOL, 8-P-	0.000	0.017
92	33.103	Butoxyethoxyethyl acetate	0.000	0.007
93	33.233	IONONE, ALPHA-	0.009	0.000
94	33.424	MENTHADIEN-9-YL ACETATE, 1,8(10)-P-	0.037	0.016
95	33.539	CARVEOL L CIS	0.035	0.022
96	33.645	NERYL BUTYRATE	0.000	0.000
97	34.313	MENTHADIEN-2-OL, CIS-1(7),8-P-	0.020	0.012
98	34.833	GERANYL  BUTYRATE	0.000	0.003
99	34.972	PHENYLETHYL ALCOHOL, 2-	0.000	0.001
100	35.529	PIPERITENONE	0.017	0.012
101	35.912	MENTHEN-9-OL PARA I	0.000	0.001
102	36.209	IONONE, BETA-	0.024	0.016
103	37.276	LINALOOL, 7-HYDROXY-6,7-DIHYDRO-	0.029	0.089
104	37.672	PYRONE, 3-HYDROXY-2-	0.110	0.886
105	37.908	MENTHADIEN-9-OL, 1,8(10)-P- I	0.108	0.086
106	38.188	MENTHADIEN-9-OL, 1,8(10)-P- II	0.013	0.007
107	38.537	EUGENOL METHYL ETHER	0.000	0.003
108	38.844	CARVONE, 1-HYDROXY-1,6-DIHYDRO-	0.013	0.000
109	39.632	NEROLIDOL, TRANS-	0.000	0.000
110	40.164	CAPRYLIC ACID	0.077	0.051
111	40.407	CUBENOL, 1,10-DIEPI-	0.015	0.000
112	40.822	ELEMOL	0.040	0.027
113	41.116	MENTHANEDIOL, CIS-1,8-P-	0.024	0.110
114	41.239	MENTHOL, 8-HYDROXY, NEO-	0.026	0.026
115	41.48	CYCLOHEXADIENONE, 2,6-DITERT.-BUTYL-4-HYDROXY-4-METHYL-2,5-	0.017	0.000
116	41.863	MENTHENE-1,8-DIOL, TRANS-2-P-	0.000	0.023
117	42.97	Alloisolongifolen	0.020	0.000
118	43.854	THYMOL	0.048	0.019
119	44.126	MUUROLOL, T-	0.048	0.024
120	45.196	DOCOSANE	0.000	0.050
121	45.475	SINENSAL, 2E,6E-BETA-	0.118	0.058
122	45.844	MENTHENE-1,2-DIOL-8-P-	0.046	0.035
123	46.291	GAMMA UNDECALACTONE	0.024	0.015
124	46.41	MENTHENE-1,2-DIOL-8-P-	0.000	0.069
125	46.819	Docosane isomer	0.000	0.215
126	46.837	CAPRIC ACID	0.031	0.000
127	47.464	MENTHANEDIOL, 2,8-P- II	0.000	0.020
128	48.201	TRICOSANE	0.000	0.298
129	48.439	SINENSAL, 2E,6E,9E-ALPHA-	0.048	0.026
130	50.166	DOCOSANE isomer	0.000	0.114
131	51.07	TETRACOSANE	0.000	0.114
132	51.399	CASCARILLIC ACID, CIS-	0.046	0.038
133	51.83	ABALYN (MAIN PEAK)	0.000	0.030
134	51.996	ABALYN D-E	0.017	0.034
135	52.388	ABALYN (MAIN PEAK)	0.000	0.036
136	52.569	N-DOCOSANE isomer	0.000	0.288
137	52.569	HYDROXYMETHYLFURFURALE, 5-	0.000	0.042
138	52.818	METHYL LINOLEATE	0.000	0.102
139	52.826	LAURIC ACID	0.094	0.000
140	52.992	ETHYL OLEATE	0.051	0.000
141	53.538	NOOTKATONE	0.085	0.054
142	53.859	PENTACOSANE	0.000	0.261
143	55.279	Tricosane isomer	0.000	0.016
144	55.695	Tetracosan isomer	0.000	0.099
145	56.526	HEXACOSANE	0.000	0.032
146	57.903	Tetracosane isomer	0.000	0.058
147	58.434	MYRISTIC ACID	0.051	0.031
148	58.908	Cryptomeridiol ?	0.000	0.019
149	59.109	HEPTACOSANE	0.000	0.046
150	61.083	PENTADECANOIC ACID	0.000	0.023
151	63.636	PALMITIC ACID	1.011	5.170
152	64.528	9-Hexadecenoic acid	0.000	0.130
153	67.71	ABALYN D-E	0.000	0.206
154	70.818	OLEIC ACID isomer	0.000	0.090
155	71.028	OLEIC ACID	0.461	2.205
156	72.818	LINOLIC ACID	0.505	2.608
SUM	150.12	114.98

   
从上述结果来看，从橙汁饮料里面一共鉴定测定了156个香气挥发性组分。主要是甜橙油的组分。柠稀含量很高，另外添加乙醛，乙酸乙酯，丁酸乙酯，脂肪醛，松油醇，等组分。部分组分含量从添加的果汁而来，部分从添加的食用香料香精而来。添加部分的天然油成分为主，附加一些其他香料组成。还有乳化剂等。
2.4. 用乙醚戊烷（1:1）提取的组分量要比二氯甲烷提取多一些，总量也多些。分别是150和115mg/kg。但有些组分二氯甲烷提取多一些，有些用乙醚：戊烷（1:1）没有提取到。
2.5. 一般讲，用二氯甲烷萃取对极性组分和非极性组分都可以提取，试剂容易得到。不像乙醚购买手续复杂，使用前还必须重蒸处理。但二氯甲烷在极性柱子上面和乙醇峰靠近，由于溶剂延迟而无法检查到乙缩醛，乙酸乙酯等组分。另外二氯甲烷属于卤素化合物可能会对环境（臭氧层）有影响，根据蒙特利尔国家化学公约，应当减少其使用。