主题：【资料】－芯片毛细管电泳

毛细管电泳芯片的狭缝深度一般为 10 ～40μm，宽度为 60～200μm。电泳芯片分离微通道的结构主要有直线型、螺旋形、多边形、弯曲形等。其中直线形结构简单、分离效率高，但仅适用于较短的分离通道，螺旋形具有较大的曲率半径，分离效率较高，适合于较长的分离通道。多边形结构紧凑，但在拐点处存在死体积区，使分离效率降低。弯曲形具有结构紧凑的特点，但由于弯曲处的“跑道效应”,将使样品区带增宽。随着人们研究的深入，通道数量也在不断地增多，从最初 Harrison 和 Manz 研究的单通道结构， 到后来的 8 通道、12 通道、16通道，48通道、96通道，发展到现在 Mathies 研究的 384 个通道。

2 　芯片毛细管电泳的进样
    在芯片毛细管电泳中，进样量一般为 pL 级，它对进样的要求比较严格，极小的微毛细管沟道尺寸更增加了进样难度，因此为达到高效而快速分离检测目的，现在大多采用的是电迁移进样模式下的二维十字交叉形进样口结构(见图 1)，此结构的优点是可以通过电压转换实现在线进样，排除了外界干扰，易于进行定量分析。在芯片毛细管电泳中，由于进样通道和分离通道交叉形成了一个注样区域，因此其进样方式与传统的毛细管电泳有一定的差别。Alarie等在芯片毛细管电泳中采用了夹流进样技术，显著地提高进样重现性。


芯片毛细管电泳进样方式主要是采用电迁移进样，电迁移进样又分为“悬浮进样”“夹流进样”和“门式进样”,悬浮进样是进样时在样品池加一定的电压，样品在电流作用下进入分离通道，待进完样后，将高压转向缓冲池，样品开始分离。悬浮进样的进样量与所加的电压有关，淌度大的物质进样就快，存在电迁移进样歧视。夹流进样则是进样时在样品池、缓冲液池和分离废液池的每个池两端分别施加上一定的电压，将样品废液池接地，通过加不同的电压来控制进样时合适的电场强度可以减少电迁移进样歧视，提高了进样的精确性，夹流进样可有效地防止试样带的扩散和试样通道中试样向分离通道的泄漏。而门式进样是在每个池上均加有电压，分离电压加在分离通道前端和缓冲池的一侧，当启动高压时，部分高压流向样品池，此时样品废液池和检测池必须接地。这种进样方式可进行连续进样，但也存在较大的样品歧视。另外，毛细管电泳芯片根据芯片结构的不同还有“十字形”和“T 字形” ，两种不同进样通道的设计。近来 Lunte 的研究小组首次采用微渗析进样与毛细管电泳芯片进行在线耦合的方法通过检测β-D-牛乳糖的量监控荧光素单-β-D-吡喃(型)半乳糖苷的水解情况。

3 　芯片毛细管电泳的检测手段
3. 1 　光检测
3. 1. 1 　紫外检测
    紫外(UV)检测的原理是用氘灯或激光作为光源，通过波长选择器、光电转换器、滤波器等器件检测被测样品的紫外吸收峰。由于灵敏度受到限制，在芯片上用得不多，故很多化合物不能用 UV检测，王刚等采用芯片毛细管电泳紫外检测仪联用进行了蛋白质的研究。在毛细管电泳芯片中，除了吸收光路长度短，灵敏度低外，玻璃、高聚物材料对紫外光也有吸收，因此在芯片上利用吸光度进行检测的还是比较少的。

3. 1. 2 　化学发光检测
    化学发光检测的原理是在检测窗口引入发光试剂，使它与分析物复合发光，通过检测此光信号达到检测分析物的目的。化学发光检测具有灵敏度高、结构简单和不需要任何外加光源等特点，近年来已在毛细管及玻璃芯片电泳检测中应用。颜流水[27 等根据氨基酸与铜离子生成的不饱和配合物具有比铜离子本身更强的催化鲁米诺发光能力的原理，以精氨酸和天冬氨酸标准物为对象，评估了芯片毛细管电泳2化学发光检测氨基酸的可行性。黄香宜等采用芯片毛细管电泳化学发光检测用于蛋白质分析。但常规毛细管电泳-化学发光检测器
(CE-CL) 的接口难以制作且容易引入死体积和湍流现象，造成分离效率下降。由于在芯片上能制作柱后反应器以避免这类问题，理论上来讲用化学发光对 ICE 芯片检测器将是简单而有潜力的。

3. 1. 3 　激光诱导荧光检测
    激光诱导荧光检测(LIF)技术分为透射型与反射型两种工作方式，后者由于适用于各种基片材料的检测，得到了广泛应用。激光诱导荧光检测利用共聚焦光学系统可以基本消除包括芯片表面散射光、丁达尔散射光、瑞利散射光、拉曼散射光等干扰。一般来说，根据研究的不同，分为点检测和区域检测。点检测采用光电倍增管(PMT)对发射荧光进行接收和检测，其优点在于检测的灵敏度很高。区域检测则是用激光束聚焦在所检测区域(光斑直径远大于点检测)，通过一定的光路，利用电感耦合器件(CCD) 进行成像和观察。由于毛细管电泳芯片的进样量很小，要求使用灵敏度较高的检测器，LIF可满足这方面的要求。但其体积庞大，光学系统技术复杂，难以适应系统微型化的要求。姚波等采用芯片毛细管电泳与荧光检测联
用利用实现了单细胞检测。

3. 2 　质谱检测
    质谱检测(MS)的原理与其他检测方法不同，它是根据分子的荷质比的不同达到分离的目的。它不仅可以区分不同分子质量的分析物，可以区分不同质量分裂模式的分析物，还可以提供化合物单一组分的结构信息，从而达到鉴定组分的目的，将 ICE芯片与 MS 联结得到的信息最丰富，不仅可以分离复合物而且可以鉴定各组分。质谱检测的灵敏度高，结构分析能力强，特别适用于痕量物质的有效检测，但 ICE 与 MS 的连接方式一直是大家关注的热点，这项技术的难点在于接口的设计。Chen等报道了在基于 PMMA 的芯片槽道口粘合毛细管纳喷头(镀银) 做Chip-MS-MS分析，可以减少死体积并应用到1.5 pmol的牛血清白蛋白的胶上酶解产物的鉴定。

3. 3 　电化学检测
3. 3. 1 　安培检测
    安培检测的原理是基于具有电活性物质在电极上发生氧化还原反应从而产生响应电流信号而进行检测的一种方法。在芯片毛细管电泳分离过程中，毛细管两端施加高压，毛细管中的电流要远远大于电极上所产生的电化学电流，这对检测产生影响。基于此，为了消除高压电场对电化学检测的影响，金亚等设计和制作了两种集成了微管道网络和超微铂电极的微流控电化学芯片，使用了芯片毛细管电泳对神经递质进行分离，研究了分离电场对于电化学检测的干扰，并进一步对系统进行了改进将多孔膜结构和超微电极集成在微管道网络中，以屏蔽高压电场。Woolley等首次报道了毛细管电泳芯片与安培检测器的联用。孟飞等研制了一种适配于壁喷式微型圆盘工作电极的、具有半自动安培检测池的集成化毛细管电泳检测芯片。这种装置既提高了CE-AD系统的微型化和集成化程度，又改善了系统的分析性能。Yan等使用无电镀沉积技术 (Electroless deposition) 和微成型毛细管技术制作芯片毛细管电泳铜微电极以及金微电极安培检测系统，并检测了葡萄糖、多巴胺和儿茶酚。Wang等最近用掺硼金刚石膜电极检测TNT等硝基芳香爆炸物、有机磷化合物以及酚类，Wang等又采用毛细管电泳芯片安培法在柱检测分析L-多巴、多巴胺和异丙肾上腺素，Wang等还研制了利用芯片毛细管电泳双电导/ 安培检测系统同时检测离子和电活性物质，Zeng等研制了一种毛细管电泳芯片柱端安培检测器，以此检测了神经递质类物 质 盐 酸 多 巴 胺、5-羟 色 胺 和 肾 上 腺 素。Keynton等还设计了一种多电极阵列的检测装置集成在芯片上。

3. 3. 2 　电导检测
    电导率检测的原理是将两个电极置于电解质溶液中，在两个电极上加上一个交流电压，溶液中的离子在交流电场的作用下会发生迁移，从而产生电流，此电流的大小与溶液的电导率成正比。通过对电导率的检测，可以检测离子的浓度。电导检测又可分为接触式电导检测和非接触式电导检测。在接触式电导检测中工作电极与毛细管缓冲介质中相连接，分析物经毛细管被工作电极检测出，这种方法的缺点是电极易受损坏。与之相对，非接触式电导检测中工作电极环在毛细管外，高频信号传送到检测器电极上，因此电极可检测到较强的信号变化。Wang等采用贴在有机玻璃电泳芯片上的铝铂条作为工作电极，分离电压为15 V，检测了 K+、Na +、SO42- 、Cl -和 F- 等离子，检出限为 2. 5μmol •L- 1。Wang等将非接触式的集成在芯片上的电导检测器在同一个微通道中同时分离检测阴离子和阳离子。

3. 3. 3 　电位检测
    电位检测的原理是溶液中的离子有选择地转移到亲脂性的膜上，导致检测器内部填充溶液与样品溶液的电位差，此电位差是两种溶液中活性离子比率对数的线性函数，由此关系可以对样品进行检测。Hauser 的研究小组对芯片毛细管电泳电位检测联用进行了研究报道。

3. 4 　其它检测手段
可用于 ICE 芯片的其它的检测体系有 NMR 检测、拉曼光谱法及全息折射指数法及喇曼光谱法等。

4 　芯片毛细管电泳的应用
4. 1 　核酸分析
    芯片毛细管电泳用于寡核苷酸的分离、DNA 的分离检测、DNA 测序和 DNA 限制性片段分离等研究应用非常多。Tiana等利用羟乙基纤维素( HEC) 作为一种滤网基质在未涂层的毛细管电泳芯片上激光诱导荧光分离检测了 dsDNA 片段。Xu等则采用了单通道芯片作为分析基体，与等速电泳富集技术相结合，提高了芯片毛细管电泳检测分离 DNA 片段的灵敏度。Lin等对双链 DNA进行分离研究。在 DNA 片段分离和 DNA 测序中，芯片毛细管电泳有着十分强大的优势，所以研究成果比较多，Zhang和 Liu对这部分内容作了详细的综述。

4. 2 　蛋白质、多肽分析
      多肽组图的绘制对鉴别蛋白质的序列和功能有着很重要的意义。这个巨大的分析挑战使得很多小组发明了芯片毛细管电泳和质谱联用的技术用来快速分离分析蛋白质片段[68 。黄淮青等采用芯片上等速电泳预浓缩-无胶筛分分离蛋白质，Xiao等选用 PDMS 基体芯片，在分离通道壁上修饰了一层聚丙烯酰胺，芯片微通道高 10μm 宽 30μm，T 字形进样口，35 s 内分离了溶菌酶和细胞色素两种蛋白质大分子。

4. 3 　氨基酸的分离
    由于氨基酸在生物临床中的重大意义，人们发展了一系列有效的分离检测手段来实现对氨基酸的检测。芯片毛细管电泳在氨基酸的分离研究方面也有应用，王辉等利用芯片毛细管电泳技术对氨基酸对映体的拆分进行了研究。Wang等采用了安培检测的电泳芯片分离检测了芳香类氨基酸，分离快速有效，无需衍生化。峰高和迁移时间相对标准偏差均小于 5 %，稳定性良好，该方法对生命科学中氨基酸的检测有重要意义。

4. 4 　糖类化合物的分离检测
    糖的监测对糖尿病患者非常重要。Wang等利用金涂层碳电极在同一芯片上设计了一个在线柱前微反应器，进行多酶的氧化还原反应，同时检测了酒中的糖和乙醇。毛秀丽[74 等以芯片为载体的糖蛋白中不同类别糖链的糖进行了分析研究。

4. 5 　药物分析
    安非他明是一种对中枢神经系统有刺激性作用的药物，它和它的相似物的分离对于临床诊断及法医学具有非常重要的意义。Wallenborg等利用一种玻璃电泳芯片对安非他明和它的相似物进行了标定和分析。高雁等在芯片毛细管电泳上采用中性环糊精对碱性药物的手性拆分进行了研究。

4. 6 　其它方面的应用
      Wang、Zeng、闫琴等对神经递质类药物进行了分离检测研究。另外还有生物细胞的检测、单分子检测、免疫分析以及基因分析等应用研究。

5 　芯片毛细管电泳的发展展望
    芯片毛细管电泳是芯片技术中一种，在芯片基质上制作多个电泳通道进行平行分析，为实验室提供一种高效、快速、灵敏、高通量的分析技术。近年来，其设计越来越多样化，应用也在不断扩大。不仅在生化研究领域占据一席之地，而且在临床、医药和环境等领域也崭露了头脚。但其目前的各种检测方法在检测灵敏度等方面还需要进一步地提高。因此，对现有检测方法的改进与对高选择性和高灵敏度的检测新方法的研究都具有重要的意义。尽管目前还不能把检测系统缩微到芯片上，但随着其检测系统及其接口的研制、微型技术的不断发展，集成度的不断提高，芯片毛细管电泳技术必将引起药物筛选、核酸分析、基因工程、临床检测、药物遗传学和蛋白质组学等革命性的变化。

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