主题:【第十二届原创】趣谈凝胶渗透色谱GPC/SEC– 检测篇III粘度检测器

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p3200617
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10月三等奖
终于聊到了粘度检测器,博士刚刚接触的时候觉得这是GPC检测器中最复杂也是最有意思的检测器,事实证明,确实如此!
好多故事,我们从GPC在线粘度检测器的起源聊起吧。话说1983年的时候,美国的MaxHaney博士(下图)在一个很大的石化公司实验室中做实验。很经典但很无聊的实验,使用乌式毛细管粘度计测粘度,一边盯着超级恒温槽中粘度计液面一手拿着一个秒表计时。有多无聊?一个高分子溶液配置若干浓度,检测每一个溶液的相对粘度,然后换算成增比粘度,然后多点外推得到特性粘度,然后利用Mark-Houwink方程计算粘均分子量,然后,再继续检测下一个样品……啊,这日子没法过了。


Max经常思维奔逸(褒义词啊),一天他看到了一个电路- 惠斯通电桥(上图)。通过惠斯通电桥可以准确检测电路的电阻。咦?既然这样的话,粘度不也是一种阻力吗?把导线换成流路岂不是可以检测溶液的粘度?Max相当兴奋,他第一时间把这个想法告诉了他的老板,但,他的老板不Care!并,希望他回到岗位继续看表测粘度。真绝望啊!
要说一个成功男人的背后,基本都有一个伟大的女人。这个女人就是Max的老婆。回家后,Max和他太太诉说了心中的苦闷,他太太对于他的想法非常支持,并鼓励他把想法变为现实。于是,出现了与凝胶色谱连用的四毛细管粘度检测器(84年),于是出现了ViscotekCo,于是Max的老板成了他的第一个客户。
历史上曾经出现过不同设计的GPC粘度检测器,有W公司的三毛细管设计也有D公司的双毛细管设计,但事实证明,Max的四毛细管设计最为成功,在灵敏度和稳定性以及桥路平衡上实现了性能的最优,并成为唯一延续下来的经典。


特性粘度和在线粘度检测器工作原理
微分粘度计—设计


GPC在线粘度检测器再使用的过程中必须与一个浓度检测器一起连用,以提供每个流出组分的浓度信息,大部分时候是RI检测器。由于粘度检测器需要分流,在检测器序列中需要放在最后,而RI检测器的耐压性最差也需要放在最后,所以大部分公司的RI和粘度采用并联。也有公司例外,采用串联并把RI放在前端,但是RI必须进行良好的过压保护。
常见的微分粘度计采用的是Haney发明的四毛细管桥路结构。如图所示,四根内径相同的毛细管(R1-R4)以与电路中常见的惠斯通电桥类似的平衡式桥路结构。微分压力传感器测量桥路中点(DP)的压力差以及入口与出口间(IP)的压力差。在毛细管R4上有一段延迟体积腔,它是测定高分子样品洗脱液时,用来提供溶剂经过R4毛细管的参比。此延迟体积腔应当满足以下要求:
1.延迟体积腔的容量必须大于GPC柱的净洗脱量。
2.延迟体积腔内的流阻必须远小于毛细管阻力。
此外选用的毛细管其流阻应基本一致,使DP处的压力差为零,而且能使色谱泵引起的脉冲也相互抵消。下图所示,当样品从GPC被洗脱后,DP处的测量结果与样品粘度相关。图中第一个峰是当样品溶液流经毛细管R1、R2及R3,而溶剂流过毛细管R4时测得的。第二个倒峰是由延迟体积腔内的样品被冲洗进入R4引起的。此时,毛细管R4内流过的是样品溶液,而其他三根毛细管内则是溶剂。在计算过程中并不需要对这个峰进行分析。

微分粘度计—原理


伯努利方程描述了流体流经管路的变化情况,其进出口压力差与流速Q,粘度η与阻率R有关。

如上图所示,DP处的信号等于流体流经管R3的压力差减去流经管R4和延迟体积的压力差。图中的第一个峰,在样品的洗脱过程中,由伯努利方程可以得到DP处测量值为:

式中,Q+指正回路的流速,Q-指逆回路的流速,η是样品的粘度,η0是溶剂的粘度。类似的,IP点的测量值也可以用下式表示:

用上上式除以上式可以得到:

两回路流速之比可以用每个回路的相对阻力计算:

这里需要假设所有毛细管流阻都相同。


结合式上上式与上式可得到与样品粘度η和溶剂粘度η0相关的表达式:

溶液比粘度即为:

将上式代入上上式,可得到微分粘度计的基本方程:

粘度函数
微分粘度计能够准确灵敏的测量洗脱的高分子样品的比粘度。不过,我们的目标是要测得特性粘度,它是理论上无限稀释样品的比粘度与浓度的比值。

特性粘度传统的计算方法是通过外推得到当浓度为零时ηsp/C的比值。然而在色谱检测中,没有办法也没有必要运用这种方法。对于可用于低浓度范围的GPC方法,Solomon等人指出特性粘度的单点估计已经足够准确。

之前部分中,已介绍折光系数检测法可以计算色谱洗脱液的浓度曲线Ci。在第二部分中,将光散射检测器与RI检测器联用则能计算色谱洗脱的分子量曲线。根据上上式的定义,同样也可以得到色谱的比粘度曲线,而粘度曲线可以由下式取得:

重均特性粘度的测量非常有价值,它代表了样品整体的特性粘度。可用传统的玻璃毛细管粘度计测量。有下面的推导证明:


在线粘度检测器表征分子结构

应用——流体力学半径

爱因斯坦揭示了溶液粘度与溶液中颗粒的流体力学半径有关。

Φ是溶液中总悬浮物体积中颗粒的体积分数。将其转化为浓度单位后,可与特性粘度、分子量以及流体力学半径有如下关系:


如果是三检测联用的GPC/SEC可以测量特性粘度与绝对分子量,进而得到Rh的绝对量,这对高分子研究十分有用。上图中是测得的Rh以及质量分数分布图。很明显在样品的整个分布范围内Rh能够被精确测量。
Rh的测量对表征蛋白质尤其有应用价值。如下图所示,单体、二聚体以及三聚体能分别被准确的计算出来。


应用——支化

高分子的长链支化度与特性粘度可以通过下式关联:

M,br代表了支化高分子当其分子量为M时的特性粘度,而M,lin是在分子量为M时直链高分子的特性粘度。ε是与结构有关的一个参数,其平均值约为0.8。下图中是一个支链计算的实例。下图左边是直链与支化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)高分子样品以特性粘度对分子量作图得到的Mark-Houwind曲线。尽管在这类高分子中支化的数量不大,Mark-Houwink曲线依然清晰地表明支化分子与直链分子的区别。在上式中的g’可由此计算。下图右边中是支化PDMS样品的质量分数分布以及支化分布。左侧坐标轴是支链的数目,其范围涵盖了从无支链的低分子量,在一百万道尔顿分子量时平均4个支链的,以及在最高的分子量平均每分子8个支链。

Mark-Houwink曲线
粘度计检测器还可以提供如分子构造、聚合以及支化等重要的结构信息。由上文可知,通过GPC的粘度检测器能够直接测量高分子样品的特性粘度,而特性粘度是溶液中高分子的密度倒数。作为一个直接而灵敏的结构参数,特性粘度也是高分子工业中的传统重要参数。
著名的Mark-Houwink曲线:

可通过特性粘度对分子量作双对数图得到。Mark-Houwink曲线是高分子结构分析中的重要曲线。它反映了高分子的结构变化,例如支化度或链刚性。其斜率是Mark-Houwink方程中的a,范围在0-2之间,当分子是固球体时为0,柱形结构时为2。
    Mark-Houwink曲线斜率的变化可用来判断是否有支化发生。
结论
粘度计检测器是三检测联用中最后的一个重要部分。我们已经介绍了使用RI检测器准确测定浓度曲线以及使用光散射技术准确测定分子量。粘度计检测器则能够测定所有重要的结构信息,使GPC/SEC能够用于测定高分子的支化程度或者的蛋白质的流体力学尺寸差异。这是三种不同的检测器完美组合达到的功能,而非任何单一或者双重的检测器能够实现。

普氏校正UniversalCalibration表征高分子真实分子量及其分布

在传统校准法的帖子中,当被测样品与用于校准的标样化学性质有区别时会导致误差的产生,并且这在日常实验中经常发生。因此,可以通过额外联用一个检测器(如四毛细管微分粘度计)对传统校准法进行改进,这就是普适校准法。
普适校准式1967年的时候Benoit发现的一个现象而诞生的。当时,Benoit发现如果在分子量的基础上引入特性粘度,即Mw*IV,那么不同种类高分子的流出校正曲线会重合在一起。后面理论证实了,Mw*IV正比于分子体积Vh,这就解释了这个现象,因为GPC本身就是按照分子体积而不是分子量进行分离的。
粘度检测器最早应用于普适校准法。普适校准法是一种色谱柱校准方法,不要求标样和被检测的样品具有相同分子结构。当分子量很低或者dn/dc值较小时,这种方法依然可以应用。但是,对于大部分的高分子,光散射技术测定分子量是较好的选择。粘度检测器同时也可以测量高分子的其他性质,尤其是与体积和结构有关的性质,因此三检测联用系统是本技术的发展趋势。下面将介绍两个检测器联用系统的应用实例。
正如之前所描述的,GPC的原理是通过大分子的流体力学半径或流体力学体积进行分离。因此,要准确校准色谱柱,需要在流体力学体积与保留时间之间找到关联(如通用校准法),而非分子量与保留体积之间(如传统校准法)。联用粘度计检测器可以实现这个目的。它能够直接测量特性粘度,而特性粘度与高分子的分子密度是成反比的。
分子质量与特性粘度的乘积与流体力学体积有如下关系:
MW • IV = 5/2 • NA • Vh
由于粘度计检测器通常与浓度检测器(RI或UV/VIS)联用可以直接测量特性粘度(IV),所以我们就可以Log(Vh)对保留体积(RV)作图得到校准曲线。
具体步骤如下所示:
1.分子量已知的窄分布系列样品进样
2.测量信号峰的保留体积
3.根据信号峰计算IV
4.以Log(Vh)对保留体积(Rv)作图得到校准曲线

普氏校正曲线,所有种类的标准样品都落在以分子体积-流出时间为坐标的一条曲线上


由此,在分析未知样品时,RVi的每个数据点都可以通过校准曲线找到Y = Log(Mwi • IVi)。由于使用了粘度计计算IVi,可推导得到Mwi =10Y/ IVi.

综上所述,我们就能使用在传统校准法中推导的公式来计算Mn,Mw与Mz均值。
好了,祝大家生活愉快,身体健康!
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宁博,有空讲讲凝胶色谱如果没三检测器,只有两个检测器时,支化度怎么测试计算,用不同的检测器,测试后结果的偏差来源,优缺点。
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原文由 小不董(doxw0323) 发表:宁博,有空讲讲凝胶色谱如果没三检测器,只有两个检测器时,支化度怎么测试计算,用不同的检测器,测试后结果的偏差来源,优缺点。
两个检测器是示差和粘度吗?
小不董
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原文由 p3200617(p3200617) 发表:
两个检测器是示差和粘度吗?
如果只有示差和激光光散射,或者有示差和粘度检测器,这样都可以计算支化度的吧?
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原文由 小不董(doxw0323) 发表:
如果只有示差和激光光散射,或者有示差和粘度检测器,这样都可以计算支化度的吧?


示差+多角度光散射检测器可以通过分子量Mw和分子大小Rg计算支化,但是仅限于分子大小Rg超过10个纳米的样品,因为光散射检测不到小分子Rg。
RI+粘度可以通过分子量Mw和分子大小Rh计算支化,没有大小限制,但是Mw是通过普适校正得到的,原理上讲不存在准确性的问题,但是实际操作上普适校正比较麻烦,还是要做校正曲线。
所以三检测器比较方便,RI+LS+IV检测器,光散射和RI得到分子量,IV和RI得到分子大小Rh。
之宣
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