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主题：【已应助】请教哪位知道LIC是什么? 严志伟

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发表于：2019/12/30 22:33:23 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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2019/12/30 22:33:35 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
不使用连接酶克隆


不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。


一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。

不使用连接酶克隆——ligation independent cloning
限制性内切酶切，连接酶链接形成重组质粒的克隆方法简单方便，但是作为上一个generation已经慢慢失去他的魅力。随着high throughput的时代来临，结构基因组学研究需要更高效率的克隆技术，于是LIC和Gateway就被广泛使用。这里发一篇Method paper关于slic的综述。这个方法的好处还可以串联接入多个片段，可以一步解决loop deletion和长片段克隆的问题。
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