摘要　建立离子色谱-抑制电导检测法同时测定巴比妥酸和硝酸盐的新方法。以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以5.0 mmol/L Na₂CO₃溶液为淋洗液，流量为1.0 mL/min，采用等度洗脱的方式可将巴比妥酸和硝酸盐与氟化物、氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，通过抑制电导检测，巴比妥酸的峰面积与其质量浓度在0.10～50.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9999，硝酸盐的峰面积与其质量浓度分别在0.10～30.0mg/L和30.0～50.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9994和0.9999，该方法应用巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等药品中巴比妥酸和硝酸盐同时的测定，加标回收率分别为90.4%～101.4%和98.0%～101.3%，5次平行测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为1.71%～2.39%和1.21%～2.66%，巴比妥酸和硝酸盐的最低检出限分别为0.10mg/L和0.03mg/L，方法回收率较高、重现性良好，操作简便快速，可用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中巴比妥酸和硝酸盐的定量分析。

关键词　离子色谱法；巴比妥酸；硝酸盐；巴比妥；苯巴比妥；维生素B₁₂

中图分类号：O652.63 文献标识码：文章编号：

Simultaneous determination of barbituric acid and nitrate in pharmaceuticals by ion chromatography

(Prevention and Health Protection Centre of Hubei Xingshan County， Xingshan443711， China)

Abstract A new method for simultaneous determination of barbituric acid and nitrate by ion chromatography with suppressed conductivity detection was developed. SH-AC-3 anion exchange column was used as separation column, 5.0 mmol/L Na₂CO₃ solution was used as eluent and the flow rate was 1.0 ml/min, barbituric acid and nitrates can be completely separated from common anions such as fluoride, chloride, phosphate and sulfate by isometric elution, and can be detected by inhibiting conductance, there is a good linear relationship between the peak area and the concentration of barbituric acid in the range of 0.10～50.0 mg/l, and the Correlation Coefficient R is 0.9999, the peak area of nitrate has a good linear relationship with its concentration in the range of 0.10～30.0 mg/l and 30.0～50.0 mg/l, respectively. The Correlation Coefficients R are 0.9994 and 0.9999, respectively, the method was applied to the simultaneous determination of barbituric acid and nitrate in barbiturate, phenobarbital and vitamin B₁₂. The recoveries were 90.4% ～101.4% and 98.0% ～101.3% , respectively, the relative standard deviation (RSD) was 1.71% ～2.39% and 1.21% ～ 2.66% , respectively. The minimum detection limits of barbituric acid and nitrate were 0.10 mg/l and 0.03 mg/l, respectively, the method is simple and fast, and can be used for the barbituric acid and nitrate Quantitative analysis of barbiturate, phenobarbital and vitamin B₁₂.

Key words ion chromatography；barbituric acid；nitrate；Barbiturates；phenobarbital；vitamin B₁₂

巴比妥酸是合成巴比妥、苯巴比妥等镇静催眠药和维生素B₁₂等药品的中间体^[1]，但由于巴比妥酸在生理条件下99%以上是离子状态而无疗效^[2]，因此监测巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等药品中的巴比妥酸具有重要意义。

硝酸盐对人体有害，过量摄入可能导致高铁血红蛋白血症，并在体内转化成致癌性的亚硝胺^[³^]，持续少量摄入也会引起消化不良、精神抑郁和头痛^[⁴^]，中国药典对相关药品中硝酸盐的含量都有明确的限量要求如维生素B₁原料药中硝酸盐含量不得大于0.25%^[⁵^]，因此监测药品中硝酸盐含量对保障用药安全具有重要意义。目前测定药品中微量巴比妥酸的方法已报道的仅有化学发光法^[⁶^]和分光光度法^[⁷^],其中,化学发光法需要专用仪器,而分光光度法则灵敏度偏低。离子色谱法目前已成为测定无机阴离子和有机酸的首选方法，已应用于维生素B₁注射液中的EDTA及硝酸根离子的同时测定^[⁴^]和水、尿液、食品等样品中邻苯二甲酸(根)、草酸、枸橼酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乙醇酸、甲酸、乙酸、酒石酸、氨基磺酸等有机酸的定量分析^[^8-14^]，但测定药品中巴比妥酸尚未见报道。本实验研究用SH-AC-3型阴离子交换柱和CIC-100型色谱仪同时测定巴比妥、苯巴比妥和维生素B12等药品中的巴比妥酸和硝酸盐的色谱条件和可行性，结果表明，以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱、5.0mmol/LNa₂CO₃溶液作淋洗液，流量为1.0ml/min,采用等度洗脱的方式可使巴比妥酸和硝酸盐与氟化物、氯化物、亚硝酸盐、溴化物、磷酸盐、硫酸盐等常见阴离子完全分离，且巴比妥酸的峰面积与其质量浓度在0.10～50.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9999，硝酸盐的峰面积与其质量浓度分别在0.10～30.0mg/L和30.0～50.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9994和0.9999，方法应用于巴比妥、维生素B₁₂和苯巴比妥等样品中巴比妥酸和硝酸盐的同时测定，并在3种样中分别添加1.0、5.0、10.0mg/L的巴比妥酸和硝酸盐，分别平行测定5次，加标回收率分别为90.4%～101.4%和98.0%～101.3%，测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为1.71%～2.39%和1.21%～2.66%，按3倍信噪比（3N/b）计,巴比妥酸和硝酸盐的最低检出限分别为0.10mg/L和0.03mg/L,方法适用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中的巴比妥酸和硝酸盐的同时测定。

1　实验部分

1.1　主要仪器与试剂

离子色谱仪：CIC-100，青岛盛瀚色谱公司。

抑制器：SHY-2型自再生抑制器,青岛盛瀚色谱公司。

定量环体积：25μL；

自动进样器：SHA—15型，青岛盛瀚色谱公司。

0.45μm滤膜过滤器：13 mm，青岛盛瀚色谱公司。

巴比妥酸（C₄H₄N₂O₃·2H₂O）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

巴比妥酸标准溶液：1000mg/L，称取1.2942g巴比妥酸，溶解于高纯水,定容至1000ml容量瓶。

磷酸二氢钾、溴化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

H₂PO₄^-标准溶液：1000 mg/L，称取磷酸二氢钾0.1402g用高纯水溶解，定容至100mL容量瓶。

Br^-标准溶液：1000 mg/L，准确称取0.1489g在105℃烘烤2h的溴化钾，高纯水溶解定容至100ml容量瓶。

NO₃^-、F^-、Cl^-、SO₄^2-、NO₂^-标准溶液：均为1000 mg/L，编号分别为GBW(E)080223、GBW(E)080549、GBW(E)080268、GBW(E)080266、GBW(E)080264，中国计量科学研究院。

无水碳酸钠、碳酸氢钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验所用其它试剂均为AR级。

实验用水为高纯水（电阻率为18.2ΜΩ·cm）。

1.2　仪器工作条件

色谱分离柱：SH-AC-3型阴离子交换柱（250 mm×4.0 mm，青岛盛瀚色谱公司）；保护柱：SH-AC-3型（50 mm×4.0 mm,青岛盛瀚色谱公司）；淋洗液:5.0mmol/LNa₂CO₃溶液，流量为1.0ml/min；柱箱温度：35℃；电流：75mA；检测器：电导检测器；自动进样器：全定量环取样，取样后清洗（每针之间），置换量70μL，取样量25μL，扎针深度4mm。

1.3　实验方法

1.3.1　标准溶液配制

巴比妥酸和NO₃^-混合标准应用液：临用前将巴比妥酸和NO₃^-标准溶液稀释成含巴比妥酸和NO₃^-均为10.0mg/L（A液）和100.0mg/L（B液）。

取巴比妥酸和NO₃^-混合标准应用液（A液）0.10、0.25、0.50、1.00mL及B液0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10只10mL容量瓶中加纯水至刻度，混匀，配制成含巴比妥酸和NO₃^-均为0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.0mg/L的系列标准工作溶液。

1.3.2标准曲线绘制

取1.3.1制备的系列标准工作溶液，各管取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样，分别测定，以巴比妥酸和硝酸盐的峰面积(y)为纵坐标，以色谱峰面积对应的巴比妥酸和NO₃^-的质量浓度(x)为横坐标，绘制工作曲线。

1.3.3 样品处理

称取巴比妥0.250g加5mL无水乙醇溶解后,用高纯水定容至100ml,取该样液用高纯水稀释1倍并经0.45μm滤膜过滤后供测试,样品测试液中巴比妥的质量浓度为1250mg/L。

将苯巴比妥片研磨均匀称取0.420g（含苯巴比妥200mg）加10mL无水乙醇充分搅拌溶解后,用高纯水定容至100ml,滤去不溶物，滤液用高纯水稀释1倍并经0.45μm滤膜过滤后供测试,样品测试液中苯巴比妥的质量浓度为1000mg/L。

取维生素B₁₂片40片（含维生素B₁₂约1000μg）用高纯水洗去表面糖衣后，加高纯水充分研磨溶解并定容至100ml,滤去不溶物，滤液用0.45μm滤膜过滤后供测试,样品测试液中维生素B₁₂的质量浓度为10mg/L。

1.3.4样品测定

取1.3.3的样品测试液1.5ml于样品瓶中，启动自动进样器进样测定巴比妥酸和NO₃^-的峰面积，以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。

2　结果与讨论

2.1　色谱条件的选择

2.1.1　淋洗液的选择

试验考察了淋洗液中 Na₂CO₃与NaHCO₃溶液浓度配比分别为5+0、5+0.5、5+0.75、5+1mmol/L、流量为1.0mL/min时，SH-AC-3型柱对巴比妥酸和硝酸盐与H₂PO₄^-、硫酸盐常见阴离子的分离情况，结果见表1，从表

表1 淋洗液中Na₂CO₃与NaHCO₃不同配比对各组分峰分离度（R）的影响

组分	Na₂CO₃+NaHCO₃(mmol/L)
组分	5+0	5+0.5	5+0.75	5+1
NO₃^-	1.94	1.62	1.25	1.30
巴比妥酸	3.59	3.94	3.58	3.55
H₂PO₄^-	0.61	1.29	2.20	2.05
SO₄^2-	/	/	/	/

1可见,随着淋洗液中NaHCO₃浓度的增加,硝酸盐的峰分离度（R）逐渐降低,巴比妥酸的峰分离度则无明显的改变,而H₂PO₄^-的峰分离度逐渐增加,为使巴比妥酸和硝酸盐均有较高的峰分离度,本试验以单纯的Na₂CO₃溶液为淋洗液。Na₂CO₃溶液浓度选择试验结果表明,当Na₂CO₃溶液浓度分别为4.0、5.0和6.0 mmol/L时,巴比妥酸的峰分离度分别为4.97、3.60和3.10，硝酸盐的峰分离度分别为2.04、1.96和1.77，完全满足相邻组分完全分离的要求（R≥1.5）^[1⁵^]，故本实验选择5.0mmol/L的Na₂CO₃溶液为淋洗液,在此淋洗条件下巴比妥酸和硝酸盐与常见阴离子的分离色谱图见图1。

2.1.2　色谱柱的选择

以5.0 mmol/L Na₂CO₃溶液为淋洗液、流量1.0 mL/min等度洗脱，考察了SH-AC-1型和SH-AC-3型阴离子交换柱对巴比妥酸和硝酸盐与其他常见阴离子的分离效果。结果表明，SH-AC-1型阴离子交换柱虽然能将氯化物、硝酸盐和硫酸盐完全分离，但不能将氯化物与巴比妥酸完全分离且巴比妥酸严重拖尾、峰形较差，SH-AC-3型阴离子交换柱不仅能将氯化物与巴比妥酸完全分离且巴比妥酸的峰形良好，试验选择SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱。

2.1.3　淋洗液流量的影响

考察了淋洗液流量分别为0.8、1.0、1.2 mL/min时各组分的分离情况，试验结果见表2，从表2可见：随着淋洗液流量的升高，各组分的保留时间（T)逐渐缩短，峰分离度（R）和峰面积逐渐降低,对于硝酸盐，当淋洗液流量从0.8mL/min上升至1.0mL/min时，保留时间缩短2.0min,峰分离度变化较小，当淋洗液流量从

表2 淋洗液流量的影响（5.0mmol/LNa₂CO₃溶液）

组分	0.8ml/min		1.0ml/min		1.2ml/min
组分	T/min	R	T/min	R	T/min	R
NO₃^-	10.741	1.94	8.678	1.98	7.359	1.77
巴比妥酸	12.319	4.04	10.025	3.90	8.391	3.75
H₂PO₄^-	16.565	/	13.430	/	11.206	/

1.0mL/min上升至1.2mL/min时，保留时间缩短1.3min,峰分离度从1.98下降至1.77；对于巴比妥酸，当淋洗液流量从0.8mL/min上升至1.0mL/min时，保留时间缩短2.3min,峰分离度从4.04下降至3.90，当淋洗液流量从1.0mL/min上升至1.2mL/min时，保留时间缩短1.6min,峰分离度从3.90下降至3.75。同时，淋洗液流量每增加0.20mL/min巴比妥酸和硝酸盐的峰面积约下降18%-20%。在保证目标分析物与其他离子良好分离的前提下，以使组分有较短的保留时间、较高的峰分离度和检测灵敏度、系统有较低的压力，综合考虑，确定淋洗液流量为1.0mL/min。

2.1.4　柱箱温度的选择

试验了柱箱温度为30℃、35℃、40℃时各组分的分离效果，结果显示，随着柱温的升高，巴比妥酸和硝酸盐的保留时间稍微缩短，峰面积逐渐增加，对于硝酸盐，当柱温从30℃上升到35℃时峰面积增加6.7%，从35℃上升到40℃时，峰面积增加5.6%，对于巴比妥酸，当柱温从30℃上升到35℃时峰面积增加4.4%，但从35℃上升到40℃时，峰面积仅增加1.6%，这与邻苯二甲酸根的试验结果^[⁸^]类似，同时硝酸盐的的峰分离度逐渐降低,分别为1.94、1.78和1.65，巴比妥酸的峰分离度则逐渐增加，分别为3.62、3.80和4.54，综合考虑待测组分的检测灵敏度和峰分离度，本试验选择的柱箱温度为35℃。

2.2共存物质的影响

分别取1.1所列各种标准溶液配制成含巴比妥酸20mg/L、硝酸盐、磷酸盐各10mg/L、氯化物、溴化物、硫酸盐、亚硝酸盐各5mg/L、氟化物3mg/L的混合标准溶液，取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样测定，以考察巴比妥酸和硝酸盐与前述6种常见阴离子的分离效果，结果见图1，从图1可知，在本试验条件下，巴比妥酸和硝酸盐与前述6种常见阴离子可以完全分离，其中磷酸盐与硫酸盐不能完全分离，除磷酸盐与硫酸盐外，其余组分的出峰顺序均在待测物之前，均不影响巴比妥酸和硝酸盐的测定。

图1巴比妥酸和硝酸盐与常见阴离子色谱图

2.3　线性方程、线性范围与检出限

按照1.3.1配制标准系列，测定巴比妥酸和硝酸盐的峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，以其质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。测定仪器30min的基线噪声^[¹⁶^]，以3倍基线噪声除以标准曲线的斜率（3N/b）计算巴比妥酸和硝酸盐的最低检出限。其标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数r（回归方程的截距、斜率和r均由仪器软件自动生成）、检出限列于表3。从表1可见，巴比妥酸的峰面积与其质量浓度在0.10～50.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9999，硝酸盐的峰面积与其质量浓度分别在0.10～30.0mg/L和30.0～50.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9994和0.9999，检出限分别为0.10mg/L和0.03mg/L。其中，10mg/L的巴比妥酸和硝酸盐的标准色谱图见图2。

表3巴比妥酸和硝酸盐的线性范围、回归方程、相关系数和检出限

组分	线性范围/mg·L^-1	线性方程	相关系数	检出限/mg·L^-1
巴比妥酸	0.10～50.0	y=4081+39810x	0.9999	0.10
NO₃^-	0.10～30.0	y=207000x-25020	0.9994	0.03
	30.0～50.0	y=1160000+171000x	0.9999
	0.10～50.0	y=24740+198300x	0.9993

图2巴比妥酸和硝酸盐的标准色谱图

2.4样品测定及加标回收试验

按1.3.3、1.3.4的步骤操作，测定巴比妥、维生素B₁₂和苯巴比妥等样品中的巴比妥酸和硝酸盐的含量。并在3种样中分别添加1.0、5.0、10.0mg/L的巴比妥酸和硝酸盐，平行测定5次，计算加标回收率及测定结果的相对标准偏差（RSD），结果见表4。由表4可知，巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等3种样品中硝酸盐的测定结果在0.15～0.22mg/L，加标回收率在98.0%～101.3%，测定结果的相对标准偏差为1.21%～2.66%，巴比妥酸含量均<0.10mg/L，加标回收率在90.4%～101.4%，测定结果的相对标准偏差为1.71%～2.39%，方法的回收率较高、重现性良好。其中苯巴比妥加标样品色谱图见图3。

图3　苯巴比妥加标样品色谱图

表4 巴比妥、苯巴比妥和维生素B12样品测定及加标回收试验结果

样品名称

组分

本底值／（mg·L^-1）

加入量／（mg·L^-1）

测得量／

（mg·L^-1）

回收率/%

RSD/%

1250mg/L巴比妥

NO₃^-

巴比妥酸

0.21

<0.10mg/L

1.0

1.14，1.20，1.18，1.21，1.22

0.893，0.901，0.904，886，0.937

98.0

90.4

2.66

2.17

1000mg/L苯巴比妥

NO₃^-

巴比妥酸

0.15

<0.10mg/L

10.0

9.94，10.13，10.16，10.21，10.26

9.95，10.01，10.39，10.17，10.20

99.0

101.4

1.21

1.71

20mg/L维生素B₁₂

NO₃^-

巴比妥酸

0.22

<0.10mg/L

5.0

5.30，5.16，5.35，5.38，5.23

5.10，4.98，4.85，4.87，4.81

101.3

98.4

1.70

2.39

3　结语

1）建立了以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以5.0 mmol/L Na2CO3溶液为淋洗液，流量为1.0 mL/min等度洗脱，离子色谱-抑制电导检测法同时测定巴比妥酸和硝酸盐的新方法。方法应用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中巴比妥酸和硝酸盐同时的测定，加标回收率分别为90.4%～101.4%和98.0%～101.3%，5次平行测定结果的相对标准偏差（RSD）小于3%，巴比妥酸和硝酸盐的最低检出限分别为0.10mg/L和0.03mg/L，方法回收率较高、重现性良好，操作简便快速，可用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中微量巴比妥酸和硝酸盐的定量分析。

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