主题：【第十五届原创】降低高压梯度引起基线噪声的研究

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houjjun

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状元秀发表于：2022/10/10 12:56:15 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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降低高压梯度引起基线噪声的研究

有些样品成分比较复杂，检测时总有几个组成色谱峰紧挨着无法完全分开，影响检测结果。为了降低实验影响，增加未完全分开色谱峰分离度，大家往往会采用梯度洗脱。梯度洗脱可以用程序控制，在不同的时间实现两种以上的流动相以不同比例混合，流动相比例发生变化极性也随之变化，对进入色谱柱不同极性的样品进行梯度式洗脱速度也发生了变化，从而实现更好的分离。说白了梯度洗脱就是通过改变流动相成分（A、B两种流动相比例）来达到改变流动相极性，从而改变流动相的洗脱能力。

梯度洗脱有几个典型的优点，比如缩短分析周期，提高分离能力，峰型好（包括峰宽小，拖尾现象好），峰型好了峰高就会偏高灵敏度一般也会偏高。但有时会引起基线漂移和基线噪声偏大。

现在梯度洗脱应用最多的有两种方式，一种是四元低压梯度洗脱，设备是一台高压泵加一套四元低压比例阀；另一种是二元高压梯度洗脱，设备是两台高压泵加一套混合器。这两种洗脱方式各有优缺点，总体来说二元高压梯度洗脱系统价格更高，实验效果也略好。

下面我们就来说说二元高压梯度洗脱应用过程中存在的问题，及我们对这些问题的研究及解决办法。

使用二元高压梯度系统，色谱基线噪声和基线漂移总是没有使用单台泵时好，色谱基线经常有较规律的波动，有时候还一会大一会小，很可能伴随有一定漂移。基线噪声大影响仪器检出限，对含量低的样品影响也是很严重。对此我们进行大量实验对如何降低高压梯度引起基线噪声进行分析研究。

实验一，找实验条件。我们配置两种流动相，开始时我们用的是纯净水和甲醇，紫外波长254nm，两台泵流速各0.5ml/min，基线噪声能看出来，但不太明显。为了效果更明显我们换用在254nm处吸光度差值更大的纯净水和1.0%丙酮水溶液作为流动相，不接色谱柱梯度混合器出来直接接检测器，这样实验效果直接被放大，看起来一目了然。

实验二，确认两台泵性能。A泵流动相纯净水，B泵流动相1.0%丙酮水溶液，我们分别用A、B泵流速从0.1ml/min以0.1为梯度往上加，直到1.0ml/min，每个梯度运行至少30min，发现泵等度运行时流速越小基线噪声也越大，0.5ml/min以上流速，基线噪声变化不大，这种现象在B泵运行时更明显。为了验证两台泵效果不一样是不是高压泵性能差异引起，我们互换两台泵流动相，现象没有明显变化，说明这种现象和这两台泵互换关系不大，主要是由两种流动相紫外吸光度大小不同所导致，吸光度大的变化也大，吸光度小的变化就小。

实验三，验证混合效果。总流速1.0ml/min，其中A泵流速从0.1ml/min以0.1为梯度往上加，B泵流速0.9ml/min以0.1为梯度往下减。实验结果A泵流速从0.1ml/min到0.5ml/min，B泵从0.9ml/min到0.5ml/min时基线噪声越来越小；A泵从0.5ml/min到0.9ml/min，B泵从0.5ml/min到0.1ml/min时又越来越大；A、B泵流速各0.5ml/min时色谱基线噪声最小；A泵0.1ml/min，B泵0.9ml/min时基线噪声最大；整个过程基线噪声都比单独运行每一台泵同阶段时大。从整个过程来看流动相响应值是越来越大的，这说明流动相中丙酮含量越高色谱响应值越大，符合在该波长下丙酮吸光度大于纯净水吸光度的理论。

按梯度时的浓度分别配置，0.1%丙酮水溶液，0.2%丙酮水溶液，0.3%丙酮水溶液，0.4%丙酮水溶液，0.5%丙酮水溶液，0.6%丙酮水溶液，0.7%丙酮水溶液，0.8%丙酮水溶液，0.9%丙酮水溶液作为流动相，用A、B泵分别单独输送以上9种流动相，结果色谱基线噪声都很小，而且无明显变化。从整个过程来看流动相响应值是越来越大的，和上面实验结果是一致的。

分析。综合以上实验，色谱基线噪声波动比较有规律，有时大有时小，很像是流动相中溶解气体所致，下面需要在系统中增加一台多通道在线脱气机验证。针对泵小流速时色谱基线噪声大的现象，我们经过分析认为可能是泵在小流速时脉动比较大引起的，下面需要在每一台泵中增加一套脉动阻尼器验证。同样的流动相成分梯度时色谱基线噪声要比等度时大，说明梯度时两种流动相混合程度不够（没有均匀、完全的混合）下面需要更换不同混合器验证。

实验四，验证流动相中溶解气体影响。高压梯度系统中增加一台在线脱气机，A、B泵同时接上在线脱气机。单独运行A泵，流速从0.1ml/min以0.1为梯度往上加，直到1.0ml/min；单独运行B泵，流速变化同A泵一样；A、B泵走梯度，总流速1.0ml/min，其中A泵流速从0.1ml/min以0.1为梯度往上加，B泵流速0.9ml/min以0.1为梯度往下减。实验结果，这三种运行方式色谱基线噪声都变小了一些，其中梯度时变化最大，原来最大的可达8mAu左右变成了现在的1.5mAu左右（A泵0.1ml/min流速，B泵0.9ml/min流速时），而且很稳定，大小几乎无变化，不像之前有时一会大一会小，效果很明显。可见梯度洗脱时流动相中溶解的气体对色谱基线噪声影响确实比较大（等度无明显影响），系统中加在线脱气机确实能解决一部分问题，加在线脱气机还是很有必要的。但基线噪声仍然存在，而且相对还是比较大，我们还需要继续研究、分析、进一步做实验验证。

实验五，验证高压泵小流速时脉动大问题。在系统每一台泵中增加一套脉动阻尼器，在线脱气机暂时不加。我们有两种柱状规格阻尼器，分别是内径4.6mm，长150mm，内径4.6mm，长250mm。泵流速同实验四。实验结果，这三种运行方式色谱基线噪声都变小了一些，其中还是梯度时变化最大，两台泵都用150mm长阻尼器时色谱基线噪声从原来最大的8mAu左右变成了现在的2mAu左右（A泵0.1ml/min流速，B泵0.9ml/min流速时）。两台泵都用250mm长阻尼器时色谱基线噪声从原来最大的8mAu左右变成了现在的1.5mAu左右（A泵0.1ml/min流速，B泵0.9ml/min流速时），效果也是很明显。系统加上在线脱气机两台泵都用150mm长阻尼器基线噪声最大可降到0.5mAu左右；都用250mm长阻尼器基线噪声最大可降到0.35mAu左右。可见梯度洗脱时高压泵脉动对色谱基线噪声影响确实比较大，尤其是至少有一台泵流速较小时。所以二元高压梯度系统所用的两台泵脉动一定的好，否则色谱基线噪声会较大；如果泵脉动实在是控制不下来，那就建议在每台泵中增加一套效果好一些的脉动阻尼器，以减小影响。到此，系统经过两次改进，基线噪声已经能降低了二十多倍。但与等度相比仍然要高很多，所以我们仍需继续研究、分析、进一步做实验验证。

实验六，验证混合器混合效果。为了进一步研究，我们测了一下我们原来混合器混合体积，大概是800μl左右。另外我们找了一做混合器的厂家，据说它们家混合器混合效果不错，而且规格也多，混合体积有1500μl，1000μl，800μl，500μl，400μl，200μl，160μl，100μl，80μl，50μl，30μl等，我们买了其中三款，分别是1000μl，400μl，160μl（100μl以下的混合器基本都是超高压液相色谱用，这不做考量）。这一实验验证的是混合效果，所以我们选用以上四种混合器直接走梯度。系统先不接在线脱气机和脉动阻尼器，总流速1.0ml/min，其中A泵流速从0.1ml/min以0.1为梯度往上加，B泵流速0.9ml/min以0.1为梯度往下减。实验结果，1000μl混合体积的色谱基线噪声最大大概3mAu左右，400μl体积的基线噪声最大大概7mAu左右，160μl体积的基线噪声最大大概15mAu左右。这一系列混合器混合效果还不错，400μl混合体积的就比我们800μl体积的好一点，另外也说明混合体积越大的混合器混合效果也越好。下面我们继续实验，系统加上在线脱气机和脉动阻尼器后，其它条件不变，实验结果，1000μl混合体积的色谱基线噪声最大大概0.1mAu左右，400μl体积的基线噪声最大大概0.25mAu左右，160μl体积的基线最大噪声大概0.55mAu左右。

分析总结。通过以上实验我们发现二元高压梯度洗脱系统存在引起色谱基线噪声变大的问题，其中流动相中溶解气体较多、高压泵脉动大、混合器混合效果差均是引起该问题的原因。我们对系统改进后，在系统中增加在线脱气机、增加脉动阻尼器、更换混合效果更好的混合器，色谱基线噪声从8mAu左右降到最低的0.1mAu左右，降了约80倍，实验效果非常明显，达到了研究预期。

以上我们只是做了二元高压梯度降低色谱基线噪声的研究，没接色谱柱，没具体做系统性梯度洗脱实验，下面我们把色谱系统连接完整，进行系统性实验加以验证改进效果。

实验七，验证二元高压梯度洗脱系统改进效果。

选择一较典型的需要梯度洗脱的液相色谱检测方法（被测样品中含有两种被测组分），按方法中实验条件实验。

增加脱气机前后实验效果。未加脱气机基线噪声大概2mAu，加脱气机基线噪声大概0.8mAu，增加脱气机后基线噪声明显比未加时好，而且两组分保留时间都比未加时略短一点，色谱图其它数据无明显变化，实验效果较好。

增加内径4.6mm，长250mm柱状阻尼器前后实验效果未加阻尼器基线噪声大概2mAu，加阻尼器基线噪声大概0.4mAu，增加阻尼器后基线噪声明显比未加时好，色谱图其它数据无明显变化，实验效果较好。

换混合器前后实验效果。未换混合器基线噪声大概2mAu换1000μl体积混合器后基线噪声大概0.6mAu，明显比之前时好，色谱图其它数据无明显变化。换400μl体积混合器后基线噪声，大概1.4mAu，和之前差不多，两组分保留时间都比之前略短一点，色谱图其它数据无明显变化。换160μl体积混合器后基线噪声大概3.2mAu，比之前差，两组分保留时间都比之前短，色谱图其它数据无明显变化。

加在线脱气机，加脉动阻尼器，换1000μl体积混合器后基线噪声大概0.05mAu左右；换400μl体积混合器后基线噪声大概0.1mAu左右；换160μl体积混合器后基线噪声大概0.2mAu。

混合器体积越大降低高压梯度基线噪声效果越好，市面上高压混合器最大体积有3000μl的，常规试验建议选400μl-1500μl体积的，效果较好。

影响二元高压梯度基线噪声至少有流动相溶解气、液相泵脉动、混合器三要素，降低二元高压梯度引起的基线噪声，系统增加在线脱气机、增加液相泵脉动阻尼器、更换理想的高压梯度混合器可完美的解决该问题。